Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов

Общая цель данного метода отбора проб заключается в получении образцов метаболитов Staphylococcus aureus для их последующего количественного анализа с помощью тандемной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Наша лаборатория заинтересована в изучении взаимосвязи между метаболизмом и патогенезом бактерий, имеющих значение для здоровья человека. В настоящее время в качестве модельного организма мы используем оппортунистический патоген человека Staphylococcus aureus.

Один из ключевых вопросов, на который мы хотим ответить, заключается в том, как бактерии регулируют свою физиологию и патогенность в условиях истощения питательных веществ во время инфицирования хозяина. Данный метод является преимущественным, поскольку он позволяет получить мгновенный снимок распределения специфических метаболитов между многочисленными метаболическими путями в активно растущих клетках с минимальным нарушением их физиологического состояния. Для начала проведите посев штрихом интересующих штаммов S.aureus из замороженного глицеринового стока на триптический соевый агар для получения изолированных колоний.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 16-24 часов. На следующий день инокулируйте 4 mL соево-казеинового бульона (TSB) в стерильных стеклянных пробирках для инкубации единичными колониями каждого штамма. Инкубируйте культуры в наклонном положении с ротацией при 37 °C в течение 16-20 часов.

Используйте спектрофотометр для измерения оптической плотности культур при 600 нанометрах (сокращенно OD600). На основании полученного значения разведите клетки до OD600 0,05 в 50 mL стерильной среды TSB в колбах Delong объемом 250 mL. Инкубируйте культуры при 37 °C на водяной бане при перемешивании со скоростью 280 rpm.

Каждые 30 минут измеряйте OD600. По мере увеличения оптической плотности может возникнуть необходимость разведения культур TSB, чтобы они оставались в пределах линейного диапазона поглощения спектрофотометра. Пока клетки растут, приготовьте свежие растворы экстракционного буфера, используя реагенты наивысшей доступной чистоты, как описано в текстовом протоколе.

Когда культуры достигнут OD600 от 0,8 до 1,0, перенесите их в 50 mL свежего предварительно нагретого TSB до OD600 от 0,01 до 0,05 и повторите этапы инкубации и измерения. Подготовьте слой дробленого сухого льда в подходящей емкости, например, в стеклянном блюдце, ведерке для льда или термоконтейнере. Когда оптическая плотность культур приблизится к желаемой точке сбора, добавьте 1 mL раствора для гашения в необработанную чашку Петри диаметром 35 мм и предварительно охладите на сухом льду в течение не менее 5 минут.

Для наших целей желаемым моментом сбора является достижение оптической плотности примерно 0,4–0,5. Однако этот показатель может варьироваться в зависимости от целей эксперимента. Затем вставьте фильтрующую фритту из нержавеющей стали в резиновую пробку и поместите её сверху на колбу Бунзена, подключенную к стационарной вакуумной системе или вакуумному насосу.

Включите вакуум и поместите сверху смешанную целлюлозно-эфирную мембрану. Используйте фильтр того же диаметра, что и фритта, чтобы обеспечить сбор всех клеток. Крайне важно собрать клетки и остановить метаболическую активность как можно быстрее, чтобы получить «снимок» содержания метаболитов при заданном условии.

Даже небольшие задержки могут повлиять на физиологию клеток в стационарном состоянии. При значении OD600 от 0.4 до 0.5 с помощью серологической пипетки отберите 13 mL культуры из колбы. Немедленно нанесите образец на фильтр.

После фильтрации всего образца немедленно промойте фильтр не более чем 5 mL ледяным PBS, чтобы удалить метаболиты, связанные со средой. Затем отключите вакуум и с помощью стерильного пинцета снимите фильтр с фритты. Перенесите фильтр в предварительно охлажденный раствор для стоппирования (quench solution).

Инкубируйте фильтр в гасящем растворе на сухом льду в течение не менее 20 минут. С помощью стерильного пинцета переверните фильтр в чашке Петри и с помощью микропипетки смойте клетки с мембраны в гасящий раствор. Ресуспендируйте клетки в гасящем растворе, а затем перенесите клеточную суспензию в стерильную ударопрочную пробирку объемом 2 mL, содержащую приблизительно 100 microliters силикатных бусин размером 0.1 mm.

Храните данный образец на сухом льду или при температуре -80 °C. Чтобы начать экстракцию метаболитов, сначала разморозьте образцы на влажном льду. Затем разрушьте клетки в гомогенизаторе, выполнив четыре 30-секундных цикла при 6000 rpm, с двухминутными периодами охлаждения на сухом льду между циклами.

Осадите лизаты в предварительно охлажденной микроцентрифужной пробирке в течение 15 минут при максимальной скорости центрифугирования. После центрифугирования перенесите супернатант в чистую микроцентрифужную пробирку. С помощью микропипетки перенесите небольшую часть образца в микроцентрифужную пробирку для определения количественного содержания остаточного пептида, как описано в текстовом протоколе.

Храните остаток образца при 80 °C. Ознакомьтесь с текстовым протоколом для анализа метаболитов методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Нуль-мутант CodY использовался для исследования истощения запасов аминокислот с разветвленной цепью, так как белок CodY регулирует экспрессию десятков генов в ответ на снижение концентрации этих питательных веществ.

Мутация codY практически не влияет на скорость роста клеток S.aureus. Снижение оптической плотности на отметке 3 часов указывает на этап обратного разведения, который увеличивает количество удвоений клеток перед сбором и удаляет различные молекулы, накапливающиеся во время ночного культивирования. Анализ последовательностей РНК транскриптомов двух штаммов демонстрирует значительные изменения в экспрессии генов, участвующих в синтезе аминокислот семейства аспартата.

Здесь числа под названиями генов указывают кратность изменения экспрессии у нуль-мутанта по гену codY по сравнению со штаммом дикого типа. После количественного определения экстрагированных метаболитов методом LC-MS было проведено сравнение их содержания в двух штаммах. При анализе некоторых соединений, относящихся к семейству аспартатных аминокислот, было установлено, что содержание предшественников, таких как аспартат и O-ацетилгомосерин, снижено у мутанта codY.

Напротив, количество конечных продуктов, таких как треонин и изолейцин, увеличивается. Здесь пунктирная линия обозначает пороговое значение изменений содержания для данного эксперимента. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить сбор метаболитов из Staphylococcus aureus для последующего количественного анализа с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии.

Данный протокол с соответствующими модификациями также подходит для сбора метаболитов из других видов бактерий. Поскольку бактерии реагируют на динамические изменения окружающей среды, важно выполнять этапы фильтрации и промывки быстро, чтобы минимизировать возможные физиологические изменения, вызванные отбором проб. Риск таких изменений также можно снизить, поддерживая низкую температуру пористого фильтра и PBS во время отбора проб.