Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов In Vitro

Общей целью данного эксперимента является определение уровней 5-метилцитозина во время дедифференцировки хондроцитов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в лечении дефектов хряща на основе клеток, таких как имплантация аутологичных хондроцитов. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она является надежным, простым и быстрым методом определения общего уровня метилирования ДНК для оценки фенотипа хондроцитов.

Применение этой технологии является стандартным для нашей доли имплантации аутологичных хондроцитов, поскольку метилирование ДНК во время дедифференцировки хондроцитов является основным препятствием для лечения аутологичных хондроцитов при дефектах хряща. Хотя этот метод может дать представление об уровнях метилирования ДНК при дедифференцировке хондроцитов, он также может быть применен к другим исследованиям заболеваний, таких как остеоартрит. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы прочитали протоколы в справочниках метода точечного блоттинга.

Пожалуйста, покажите, что демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как состояния точечного блоттинга трудно назвать. Геномная ДНК должна быть денатурирована, а затем серийно разбавлена. Затем опирайтесь на положительно заряженную нейлоновую мембрану.

Демонстрировать процедуры будет Чжаофэн Цзя, аспирант нашей лаборатории. Ткани суставного хряща, использованные в данном исследовании, были выделены из коленных суставов пациентов-доноров после травмы. С помощью стерильного скальпеля нарежьте хрящ кубиками на один-два кубических миллиметра.

Затем добавьте в измельченный хрящ по одному миллиграму на миллилитр коллагеназы II и DMEM. И инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов, чтобы переварить хондроциты. На следующий день отфильтруйте полученную клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров.

Вращаем ячейки вниз. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте PBS и снова убавьте обороты. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

И семена плотностью от 20 000 до 30 000 клеток на квадратный сантиметр и DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Выращивание в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Соберите субконфлюентные клетки с использованием 0,25% трипсина ЭДТА.

И реплейт с плотностью 6 600 клеток на квадратный сантиметр. Культивируйте хондроциты в монослоях до шести пассажей и оценивайте в первом, втором, третьем, четвертом и пятом пассажах. Чтобы начать эту процедуру, соберите клетки методом трипсинизации и центрифугирования.

Затем ресуспендируют клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса на 10 миллионов клеток с помощью пипетирования и быстрой инверсии. Выдерживать в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте протеиназу К в концентрации 160 микрограмм на миллилитр клеточного лизата и энергично переверните смесь.

Выдерживать в течение шести часов при температуре 55 градусов Цельсия. Добавьте к каждому образцу по одному объему Tris pH 7,9, насыщенный фенол к хлороформу и изоамиловому спирту. Тщательно встряхните образец рукой в течение примерно 20 секунд.

Центрифугируйте образцы при комнатной температуре при 13 000 умноженных на G в течение пяти минут. Удалите верхнюю водную фазу и переложите в свежую пробирку. Чтобы удалить фенол, добавьте в каждую трубку равное количество хлороформа.

Встряхните рукой и поверните вниз. Переложите верхнюю водную фазу в свежую пробирку. Добавьте 0,1 объема образца трех моляров ацетата натрия pH восемь и два объема 100% этанола.

Храните пробирки при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы осадить геномную ДНК. На следующий день центрифугируйте образцы при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут при 16 000 G для гранулирования геномной ДНК. Промойте образцы 70%-ным этанолом.

И центрифугируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух минут при 13 000 градусов по Цельсию. Осторожно удалите надосадочную жидкость и высушите гранулу ДНК на воздухе. Ресуспендируйте ДНК в 10 миллимолярных трис pH восемь 0,1 миллимоляра ЭДТА. Начните эту процедуру с денатурации выделенной ДНК в 0,1 моляре гидроксида натрия в течение 10 минут при температуре 95 градусов Цельсия.

Нейтрализуйте ДНК с помощью одного моляра ацетата аммония на льду. А затем разбавить в два раза двойной дистиллированной водой. Самым важным этапом в анализе дот-блоттинга является обнаружение пятнистости образцов, и помните, что делайте это медленно и осторожно.

Постарайтесь свести к минимуму каждый пятнистый массив до трех-четырех миллиметров в диаметре. С помощью наконечника пипетки с узким горлышком аккуратно поместите два микролитра серийно разбавленной геномной ДНК на положительно заряженную нейлоновую мембрану в центре сетки. Промокните мембрану при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем заблокируйте неспецифические сайты связывания антител, замочив мембрану в 5% BSA в TBST в 10-сантиметровой чашке Петри на один час при комнатной температуре с легким встряхиванием. Через час промойте мембрану три раза в TBST в течение пяти минут каждый раз. Инкубируйте мембрану с мышиным моноклональным антителом против 5-метилцитозина в TBST при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

На следующий день промойте мембрану три раза в TBST в течение пяти минут каждый раз. Затем инкубируют с вторичным антителом, пероксидазой хрена конъюгированного овечьего антимышиного иммуноглобулина G в TBST в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки мембраны в TBST, как и раньше, добавьте ферментный субстрат в мембрану и инкубируйте в течение пяти-10 минут.

Наконец, визуализируйте сигнал вторичного антитела с помощью хемилюминесцентного набора в соответствии с инструкциями производителя. Хондроциты, культивируемые в монослое до шестого пассажа, демонстрировали прогрессирующие фенотипические изменения, становясь сильно ущемленными и уплощенными с последующими пассажами. Это морфологическое изменение типично для процесса дедифференцировки хондроцитов.

Геномную ДНК выделяли из хондроцитов после различного количества пассажей, а уровни метилирования ДНК оценивали с помощью 5-метилцитозина, специфичного для дот-блоттинга. Интенсивность точек была затем проанализирована с помощью изображения J. Прогрессивно повышенные уровни 5 метилцитозина наблюдались при длительной субкультуре, что свидетельствует о связи между общим повышением уровня метилирования и дедифференцировкой хондроцитов. После освоения этой техники ее можно выполнить за 24 часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о максимальной концентрации и чистоте геномной ДНК. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование геномной ДНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как дедифференцировка хондроцитов в монокультуре. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области имплантации аутологичных хондроцитов к оценке ДНК-машинации хондроцитов и определению фенотипа хондроцитов при лечении хрящевых дефектов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать 5-метилцитозиновый точечный блот для обнаружения рычага дегенеративной махинации для оценки фенотипа хондроцитов. Не забывайте, что работа с фенолом может быть крайне опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует надевать перчатки.