Многослойный кортикальный Ca

Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении одновременной визуализации активности нейронов в нескольких слоях корковых нейронов с использованием кальциевых индикаторов у свободно передвигающейся мыши, а также в изучении функционирования нейронных цепей с помощью миниатюрного закрепленного на голове флуоресцентного микроскопа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной нейробиологии, например, о том, как распространяется информация между несколькими слоями коры. Основным преимуществом данной методики является возможность надежного и длительного мониторинга больших популяций генетически кодируемых нейронов в нескольких слоях коры у свободно передвигающихся животных.

Для визуализации генетически кодируемых нейронов из нескольких слоев коры головного мозга у свободно передвигающегося животного необходимо выполнить следующие процедуры; в данном протоколе основное внимание уделяется имплантации призматического зонда, установке базовой пластины и визуализации in vivo у свободно передвигающейся мыши. Чтобы приступить к этой процедуре, через одну-две недели после инъекции вируса поместите животное в стереотаксический аппарат и подготовьтесь к операции по имплантации призматического зонда, продезинфицировав его в 70% ethanol и очистив с помощью линзовой бумаги. Затем выполните круглую краниотомию, используя микродрель с бором диаметром 0,5 millimeter.

Убедитесь, что диаметр трепанационного отверстия чуть больше диаметра призмы. Затем расположите отверстие таким образом, чтобы при введении призмы в кору ее плоский край был обращен к месту инъекции вируса и находился в радиусе от 150 до 200 micron. После этого удалите твердую мозговую оболочку с помощью тонкого пинцета.

После обнажения тканей мозга постоянно поддерживайте их увлажненность с помощью стерильного физиологического раствора. Это также обеспечит необходимое давление на ткань. Чтобы снизить давление в тканях мозга при введении призматического зонда, создайте канал для введения, закрепив скальпель с прямым лезвием на держателе электродов стереотаксического аппарата.

Установите его под углом так, чтобы пластина ножа была перпендикулярна кривизне черепа и находилась в плоскости, параллельной колонне для инъекции вируса. Осторожно расположите нож над трепанационным отверстием, вдоль его внутреннего медиального края и примерно на 200 микрон латеральнее места инъекции вируса, обратив режущую кромку кзади. Обнулите ось Z, когда кончик ножа коснется мягкой мозговой оболочки.

Затем постепенно опустите его на глубину, на которую будет вводиться призматический зонд. После этого сместите нож на один миллиметр кзади, чтобы освободить путь для переднего края призмы. Медленно извлеките нож с помощью микроманипулятора стереотаксической стойки с шагом 10 мкм/с и поместите на место разреза кусочек гелевой губки, пропитанный стерильным физиологическим раствором.

После этого закрепите держатель линзы на манипуляторе стереотаксической установки под тем же углом, что и нож на предыдущем этапе. Выровняйте призму так, чтобы её плоская сторона находилась над разрезом и была параллельна колонне для введения вируса. Когда призма будет установлена под правильным углом, постепенно опускайте её в мозг с шагом 10 micron до конечного уровня Z 1.1 millimeter от поверхности мозга для данного зонда.

Закройте любые открытые ткани вокруг призмы в области краниотомии, нанеся очень тонкий защитный слой эластомерного адгезива с помощью иглы 25G. Чтобы предотвратить смещение линзы внутри краниотомии, после отверждения эластомерного адгезива нанесите с помощью иглы 25G небольшое количество цианоакрилатного клея, чтобы закрепить стекло призмы к прилегающей части черепа поверх слоя эластомерного адгезива. После отверждения цианоакрилатного клея открутите держатель линзы и осторожно извлеките микроскоп.

Затем медленно отведите манипулятор стереотаксиса, чтобы призматический зонд остался надежно имплантированным. Нанесите слой стоматологического акрила или цианоакрилатного клея вокруг имплантата, чтобы закрыть открытую поверхность черепа, не затрагивая окружающие разведенные мышечные ткани. Покрытие большой площади черепа таким краниальным колпачком в дальнейшем облегчит крепление базовой пластины.

Затем смешайте катализатор и основу из шприца с силиконовым адгезивом и поместите каплю эластомера внутрь манжеты призматического зонда, чтобы закрыть верхнюю часть линзы зонда для предотвращения повреждений и оседания пыли. Через одну неделю или 10 дней после имплантации призматического зонда проверьте экспрессию вируса в ткани с помощью имплантированного призматического зонда. Для этого удалите колпачок из силиконового адгезива с поверхности линзы имплантированного призматического зонда.

Осмотрите поверхность линзы зонда и аккуратно удалите любые загрязнения с помощью салфетки для линз и 70% ethanol, чтобы убедиться в чистоте поверхности визуализации. Затем прикрепите опорную пластину к микроскопу и затяните стопорный винт опорной пластины для ее фиксации. После этого закрепите микроскоп в зажиме для микроскопа на рычаге стереотаксического микманипулятора.

Прикрепите захват к стержню, который можно установить на рычаг стереотаксического микроманипулятора. Затем, используя рычаг стереотаксического микроманипулятора, расположите микроскоп над линзой призматического датчика. Визуально проверьте ориентацию, осмотрев призматическую линзу сбоку и сзади предметного столика для животного.

Необходимо совместить оптические оси объектива микроскопа и призматического зонда. После этого запустите программное обеспечение для сбора данных, выберите проект и включите светодиодную подсветку микроскопа с помощью программы. Оцените качество юстировки микроскопа, перемещая манипулятор стереотаксиса и фокусируясь на верхней фазе линзы имплантированного призматического зонда в программном обеспечении.

При правильной юстировке края линзы призматического зонда должны выглядеть четкими. Отрегулируйте расстояние от микроскопа до имплантированного призматического зонда, используя руку стереотаксического манипулятора для достижения необходимой фокальной плоскости внутри ткани. Затем используйте стоматологический акрил или цианоакрилат, чтобы надежно закрепить базовую пластину на акриловой крышке, перекрыв зазор.

Крайне важно не наносить клей на какие-либо части корпуса микроскопа или на стопорный винт при приклеивании базовой пластины к голове животного. Теперь освободите микроскоп из захвата и отведите захват от микроскопа. Если использовался цианоакрилат или другой прозрачный клей, покройте его черным лаком для ногтей или слоем черного стоматологического цемента, чтобы предотвратить утечку окружающего света в колпачок головы, что может привести к появлению артефактов на изображениях, полученных в ходе экспериментов.

Затем защитите имплантированный призматический зонд крышкой базовой пластины. В ходе данной процедуры подключите микроскоп к блоку сбора данных, соединенному с компьютером, и запустите программное обеспечение для сбора данных. После этого снимите крышку базовой пластины, повернув установочный винт базовой пластины против часовой стрелки и подняв крышку.

Установите микроскоп на базовую пластину на живот животного. Микроскоп должен зафиксироваться на месте с помощью магнитов на базовой пластине. Затем затяните фиксирующий винт базовой пластины до появления легкого сопротивления.

После этого выберите параметры сбора данных, включая частоту кадров. При выборе настроек проверьте гистограмму изображения, чтобы убедиться в хорошем соотношении сигнал/шум. Затем начните сбор данных.

По завершении записи ослабьте стопорный винт опорной пластины и отсоедините микроскоп от пластины, осторожно потянув его вверх. Затем установите на место крышку опорной пластины и аккуратно затяните стопорный винт. Далее представлена демонстрация животного с установленным микроскопом, которое свободно взаимодействует с объектами в арене для изучения поведения.

В ходе визуализации активности мозга бодрствующей мыши с использованием данной системы регистрировали активность нейронов соматосенсорной коры при воздействии на животное трех различных условий среды: открытого поля в первый день, ознакомления с объектом со второго по четвертый день и предъявления нового объекта на пятый день. После выделения клеток с помощью программного обеспечения для анализа данных кальциевого имиджинга пространственные фильтры, соответствующие расположению клеток, накладывались на проекцию средней интенсивности флуоресценции, полученную при записи на микроскопе.

Белая пунктирная линия разделяет клетки второго, третьего и пятого слоев. Соответствующие кривые изменения концентрации кальция в пяти клетках каждого слоя демонстрируют паттерн активности клеток в двух различных поведенческих контекстах: при ознакомлении с объектом и при воздействии нового объекта. Клетки второго и третьего слоев были более активны по сравнению с клетками пятого слоя в день, когда мышь подвергалась воздействию нового объекта.

Ниже представлены остальные графики активности клеток поверхностных нейронов в моменты, когда животное находилось в открытом поле, в процессе ознакомления с объектом и при исследовании нового объекта. После освоения каждая техника может быть выполнена в течение одного часа при правильном подходе. Разработка этого метода открывает путь исследователям в области системной нейробиологии для изучения специфических типов клеток в различных областях мозга с использованием различных поведенческих парадигм при применении дронов и других моделей нейрофизиологии заболеваний.

После изучения данного протокола должны быть получены четкие представления о том, как маркировать несколько слоев соматосенсорной коры, имплантировать призматический зонд и устанавливать миниатюрный микроскоп, закрепляемый на голове.