Электрофизиологический метод записи цельного клеточного напряжения Drosophila Фоторецепторы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить записи клещей напряжения всей ячейки от одной фоторецепторной клетки для измерения токов, индуцированных светом, возникающих при поглощении одного фотона и при повторных реакциях на интенсивный свет. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов сенсорной трансдукции, таких как визуальная трансдукция как физических, так и ионных механизмов, лежащих в основе фототрансдукции, а также свойства каналов TRP. К преимуществам использования данной методики можно отнести полный контроль напряжения мембраны и чрезвычайно высокое отношение сигнал/шум, а также возможность введения специфических показателей для оптических измерений.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут бороться с крошечным размером препарата и необходимостью быстрого выполнения вскрытия из-за временной метаболической уязвимости. Для этой процедуры поднимите мух плотностью около 20 на флакон. Во время эксперимента у вас будет несколько флаконов с куколками, которые вот-вот будут закрыты и которые находились в постоянной темноте не менее 24 часов.

За два часа до сбора взрослых уберите всех закрытых взрослых. Всегда прикасайтесь к темным отрегулированным мушкам в салфетках под красным светом. В ожидании только что сомкнувшихся мух подготовьте камеру записи.

На дне камеры закрепите покровное стекло с помощью расплавленного парафина или силиконовой смазки под высоким вакуумом, чтобы завершить ванну. Затем установите ванну на предметный столик инвертированного микроскопа. Поместите в ванну трубку системы перфузионной системы, трубку всасывающей системы и провод заземления для установки электрофизиологии.

Прежде чем приступить к вскрытию, приготовьте несколько растворов на тыльной стороне 60-миллиметровой чашки Петри. Внесите четыре отдельные капли ЭС без кальция и одну каплю ТС. Теперь с помощью грубого пинцета поймайте муху, которая недавно закрылась крыльями или телом. Затем с помощью тонкого пинцета отсоедините головку и быстро переведите головку на первую каплю ЭС без кальция. Под стереоскопом рассеките голову пополам по сагиттальной плоскости с помощью второй пары тонких пинцетов.

Убедитесь, что оба глаза остаются неповрежденными. Теперь перенесите 1/2 головы во вторую каплю ЭС без кальция, а другую половину головы — в третью каплю ЭС без кальция. Затем приступайте к рассечению одного из двух глаз.

С помощью тонкого пинцета удалите как можно больше тканей вокруг глаза, чтобы не причинить вреда сетчатке. Затем крепко возьмитесь за край роговицы тонким пинцетом и вычерпните сетчатку. В результате должна получиться пустая неповрежденная роговица, отделенная от неповрежденной сетчатки.

Пипетки хранятся в этаноле, поэтому при использовании новой пипетки для растирания всегда сначала промывайте ее водой. Теперь заполните промытую пипетку небольшим объемом ЭС без кальция из четвертой капли. Затем, используя мягкую аспирацию изо рта, втяните изолированную сетчатку в пипетку.

С особой осторожностью избегайте улавливания пузырьков воздуха. Затем поместите сетчатку в каплю TS. Затем повторите изоляцию сетчатки на втором глазу так, чтобы оба теперь находились в падении TS. Затем аккуратно сотрите с чашки Петри только ЭС без кальция и добавьте еще шесть капель ТС на поверхность чашки.

Перенесите обе сетчатки в новые капли ТС. Затем замените пипетку для растирания на ту, которая имеет отверстие малого диаметра. Промыв его, наполните пипетку каплей ТС. Используя эту пипетку, быстро и многократно аспирируйте и выдыхайте обе сетчатки, чтобы отделить некоторое количество омматидий от пигментных клеток. Когда это произойдет, TS будет затянута облаками.

Далее перенесите остатки обеих сетчаток в другую каплю ТС. Затем загрузите в пипетку мутную каплю TS, содержащую изолированный омматидий. Выдохните раствор в камеру ванны. Повторите эту процедуру с уменьшающимися пипетками меньшего диаметра до тех пор, пока сетчатка полностью не растворится.

Подождите минутку. Во время этой паузы изолированная омматидия будет связываться со дном камеры. Через минуту начните подачу ЭС, содержащей 1,5 миллимолярного кальция, с помощью перфузионной системы.

По мере заполнения камеры убедитесь, что провод заземления и всасывающая трубка погружены в воду. Дайте раствору течь в течение 60–90 секунд, прежде чем продолжить. Для начала используйте объектив 40x, чтобы внимательно осмотреть омматидию в ванне.

Обратите внимание, что удлиненные тела фоторецепторных клеток, образующие ommatidium, отделены от своих аксонов, но остаются жизнеспособными. Теперь выберите подходящий омматидий для эксперимента. Выберите, когда он соответствует следующим критериям.

Наружная мембрана должна быть гладкой и неповрежденной. Длинная ось должна находиться почти под прямым углом относительно подхода электрода с дистальной стороны. Причем омматидий не должен быть окружен какой-либо лишней тканью.

После выбора центрируйте омматидий в поле зрения. Теперь наполните пипетку подходящим для эксперимента внутриклеточным раствором. И округлите пипетку к держателю электрода.

Затем подуйте в трубку пипетки, чтобы создать положительное давление, и зафиксируйте давление, закрыв клапан трубки. Далее вставьте пипетку в камеру ванны и направляйте ее близко к дистальному отделу омматидия до тех пор, пока в мембране не будет наблюдаться небольшая ямочка, которая возникает из-за положительного давления от заплатанной пипетки. Теперь откройте модуль тестирования мембраны в программном обеспечении для записи и подайте непрерывные импульсы квадратного напряжения в два милливольта с частотой 100 герц.

Далее, используя элементы управления усилителем патч-клещей, установите потенциал перехода на ноль, чтобы установить базу квадратного импульса на нулевой ток. Затем откройте клапан, чтобы сбросить давление в пипетке, и осторожно вдохните, чтобы создать отрицательное давление. Затем пипетка должна прикрепиться к клеточной мембране.

Как только это произойдет, закройте клапан, чтобы зафиксировать давление. Теперь проверьте сопротивление электрода. Оно должно быть увеличено до 100-150 мегаом.

Затем сбросьте отрицательное давление в пипетке, снова открыв клапан. Теперь сопротивление должно подскочить до одного или двух гигаом, что указывает на образование буквы C между пипеткой и ячейкой. Далее с помощью патч-клещи усилителя сместите емкостный ток пипетки.

Чтобы создать цельную конфигурацию, разбейте клеточную мембрану с помощью аспирации через рот. Создавайте быстрые короткие силовые удары отрицательного давления в электроде. При получении конфигурации целой ячейки произойдет резкое увеличение емкости.

Затем с помощью усилителя с патч-клещей установите удерживающий потенциал на необходимое напряжение и сместите емкостные токи в последовательном сопротивлении. Теперь закройте черную французскую занавеску клетки Фарадея и начните эксперимент. После получения цельноклеточной конфигурации с помощью патч-пипетки, содержащей флуоресцентный краситель люциферного желтого цвета, можно увидеть, что только один из фоторецепторов, образующих омматидий, был загружен красителем.

Этот фоторецептор также будет электрически изолирован от своих соседей в омматидии. Омматидии, зажатые напряжением всей клетки, у мух дикого типа и мух с мутациями в генах InaC или InaD показали квантовые всплески в ответ на непрерывный тусклый свет. Медленное окончание бугорков наблюдалось у обоих мутантов по сравнению с мухами дикого типа.

Нормализованные отклики на 500-миллисекундные световые импульсы, подаваемые со скоростью 150 000 фотонов в секунду, измененная физиология аккуратно проиллюстрированы. С помощью препарата удалось даже измерить квантовый удар целого элемента, зажатый напряжением, на одну миллисекунду кратковременного тусклого света. Такие однофотонные ответы сравнивались у мушек дикого типа с мутантным арестином и ninaC мутантными.

Оба мутанта ответили шлейфом ударов. Нормализованные отклики на 500-миллисекундный световой импульс, подаваемый со скоростью 15 000 фотонов в секунду. Таким образом, медленное прекращение макроскопического ответа наблюдается у мутантов аррестина-2 и ninaC.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать полноклеточные записи из фоторецепторных клеток дрозофилы. После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. Этот метод проложил путь исследователям к лучшему пониманию каналов TRP и передачи сигналов липидов инозитола, а также роли светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки, обнаруженных у млекопитающих, которые участвуют в деятельности, не зависящей от изображения.