Электрофизиологический метод записи цельного клеточного напряжения

Общая цель данной процедуры — получение регистраций методом фиксации потенциала всей клетки (whole-cell voltage clamp) от отдельной фоторецепторной клетки для измерения светоиндуцированных токов, возникающих при поглощении одиночных фотонов, а также повторных ответов на интенсивный свет. Этот метод позволяет изучать ключевые вопросы в области сенсорной трансдукции, такие как зрительная трансдукция, включая физические и ионные механизмы, лежащие в основе фототрансдукции, а также свойства TRP-каналов. Преимущества использования данной методики включают полный контроль мембранного потенциала, чрезвычайно высокое отношение сигнал/шум и возможность введения специфических индикаторов для оптических измерений.

Как правило, специалисты, впервые осваивающие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за малого размера препарата и необходимости быстрого проведения диссекции в связи с временной метаболической уязвимостью. Для данной процедуры выращивайте мух с плотностью примерно 20 особей на флакон. К моменту начала эксперимента подготовьте несколько флаконов с куколками, которые находятся на стадии закрытия и содержались в постоянной темноте не менее 24 часов.

За два часа до сбора взрослых особей удалите всех уже вылупившихся мух. С мухами, адаптированными к темноте, всегда работайте в помещениях при освещении красным светом. Пока ждете вылупления новых мух, подготовьте регистрирующую камеру.

Прикрепите покровное стекло к дну камеры с помощью расплавленного парафина или высоковакуумной силиконовой смазки, чтобы завершить сборку ванночки. Затем установите ванночку на предметный столик инвертированного микроскопа. В ванночку вставьте трубку системы перфузии, трубку системы аспирации и заземляющий провод для электрофизиологической установки.

Перед началом диссекции приготовьте необходимые растворы на обратной стороне чашки Петри диаметром 60 миллиметров. Нанесите четыре отдельные капли безкальциевого ES и одну каплю TS. Теперь, используя грубый пинцет, захватите недавно вылупившуюся муху за крылья или тело. Затем с помощью тонкого пинцета отделите голову и быстро перенесите ее в первую каплю безкальциевого ES. Под стереомикроскопом разрежьте голову пополам вдоль сагиттальной плоскости, используя вторую пару тонкого пинцета.

Убедитесь, что оба глаза остались неповрежденными. Теперь перенесите одну половину головы во вторую каплю ES без кальция, а вторую половину — в третью каплю ES без кальция. Затем приступайте к диссекции одного из двух глаз.

С помощью тонкого пинцета удалите как можно больше тканей вокруг глаза, чтобы не повредить сетчатку. Затем крепко захватите край роговицы тонким пинцетом и извлеките сетчатку. В результате должна получиться пустая целая роговица, отделенная от целой сетчатки.

Пипетки хранятся в этаноле, поэтому при использовании новой пипетки для тритурации ее следует предварительно промыть водой. Затем заполните промытую пипетку небольшим объемом безкальциевого ES, начиная с четвертой капли. После этого с помощью осторожной аспирации ртом втяните изолированную сетчатку в пипетку.

С предельной осторожностью избегайте образования пузырьков воздуха. Затем перенесите сетчатку в каплю TS. Далее повторите процедуру выделения сетчатки из второго глаза, чтобы обе сетчатки находились в одной капле TS. После этого аккуратно удалите с поверхности чашки Петри только остатки бескальциевого ES и добавьте на поверхность чашки еще шесть капель TS.

Перенесите обе сетчатки в новые капли TS. Затем замените пипетку для тритурации на пипетку с меньшим диаметром отверстия. После промывки наполните пипетку каплей TS. С помощью этой пипетки быстро и многократно аспирируйте и экспирируйте обе сетчатки, чтобы отделить часть омматидиев от пигментных клеток. В процессе этого раствора TS станет мутным.

Затем перенесите остатки обеих сетчаток в другую каплю TS. После этого наберите в пипетку мутную каплю TS с изолированными омматидиями. Выпустите раствор в камеру для ванны. Повторяйте эту процедуру, используя пипетки для тритурации с постепенно уменьшающимся диаметром, до полного растворения сетчатки.

Теперь подождите одну минуту. За это время изолированные омматидии прикрепятся к дну камеры. Через минуту начните подачу ES, содержащего 1,5 мМ кальция, с помощью перфузионной системы.

При заполнении камеры убедитесь, что заземляющий провод и всасывающая трубка погружены в жидкость. Перед продолжением дайте раствору протекать в течение 60–90 секунд. Для начала используйте объектив 40x, чтобы внимательно осмотреть омматидии в ванночке.

Обратите внимание, что удлиненные тела фоторецепторных клеток, образующие омматидий, отделены от своих аксонов, но остаются жизнеспособными. Теперь выберите подходящий для эксперимента омматидий. Выбирайте тот, который соответствует следующим критериям.

Внешняя мембрана должна быть гладкой и целой. Должная ориентация длинной оси должна быть почти под прямым углом относительно направления подхода электрода с дистальной стороны. Кроме того, омматидий не должен быть окружен излишними тканями.

После выбора объекта центрируйте омматидий в поле зрения. Затем наполните пипетку соответствующим внутриклеточным раствором для данного эксперимента. После этого закрепите пипетку в держателе электрода.

Затем подуйте в трубку пипетки, чтобы создать положительное давление, и заблокируйте его, закрыв клапан трубки. После этого введите пипетку в камеру с раствором и подведите ее к дистальной части омматидия до появления небольшой вмятины на мембране, вызванной положительным давлением из установленной пипетки. Теперь откройте модуль тестирования мембраны в программе для регистрации данных, чтобы подать непрерывные прямоугольные импульсы напряжения 2 mV с частотой 100 Hz.

Затем, используя элементы управления усилителя patch clamp, установите потенциал соединения на ноль, чтобы привести основание квадратного импульса к нулевому току. После этого откройте клапан, чтобы сбросить давление в пипетке, и осторожно проведите аспирацию для создания отрицательного давления. После этого пипетка должна прикрепиться к клеточной мембране.

Как только это произойдет, закройте клапан, чтобы зафиксировать давление. Теперь проверьте сопротивление электрода. Оно должно увеличиться до значения от 100 до 150 МОм.

Затем сбросьте отрицательное давление в пипетке, снова открыв клапан. Сопротивление должно резко возрасти до значений от одного до двух гигаом, что указывает на формирование GΩ-контакта (гигаомного сопротивления) между пипеткой и клеткой. Далее, используя усилитель патч-клампа, компенсируйте емкостный ток пипетки.

Для создания целоклеточной конфигурации разрушите мембрану клетки с помощью аспирации ртом. Создавайте резкие, короткие и сильные импульсы отрицательного давления в электроде. После достижения целоклеточной конфигурации произойдет внезапное увеличение емкости.

Затем с помощью усилителя patch-clamp установите удерживающий потенциал до требуемого значения и скомпенсируйте емкостные токи и последовательное сопротивление. Теперь закройте черный занавес клетки Фарадея и начните эксперимент. После получения конфигурации «целая клетка» (whole-cell) с помощью патч-пипетки, содержащей флуоресцентный краситель Lucifer yellow, можно увидеть, что краситель был введен только в один из фоторецепторов, образующих омматидий.

Этот фоторецептор также будет электрически изолирован от соседних рецепторов в омматидии. В омматидиях мух дикого типа, а также мух с мутациями в генах InaC или InaD при фиксации потенциала всей клетки наблюдались квантовые всплески в ответ на непрерывный слабый свет. В обоих случаях с мутациями наблюдалось более медленное затухание всплесков по сравнению с мухами дикого типа.

Нормированные ответы на световые импульсы длительностью 500 мс при интенсивности 150 000 фотонов в секунду наглядно иллюстрируют изменения в физиологии. С помощью данной подготовки стало возможным даже измерить ответы квантового скачка (quantum bump) при фиксации потенциала всей клетки на короткие импульсы слабого света длительностью 1 мс. Такие однофотонные ответы сравнивали у мух дикого типа, мутантов по аррестину и мутантов ninaC.

Оба мутанта ответили серией всплесков. Нормализованные ответы на световой импульс длительностью 500 миллисекунд при интенсивности 15 000 фотонов в секунду. Таким образом, медленное прекращение макроскопического ответа наблюдается у мутантов по arrestin-2 и ninaC.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить регистрацию целого कोशिका (whole-cell recording) из фоторецепторных клеток Drosophila. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура занимает один час. Данный метод позволил исследователям лучше изучить TRP-каналы и инозитол-липидную сигнализацию, а также роль внутренне светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки млекопитающих, которые участвуют в светозависимых процессах, не связанных с формированием изображения.