Флэш-и-Фриз: Роман Техника для захвата мембраны динамика с электронной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы зафиксировать динамику мембраны с помощью электронной микроскопии после индукции нейронной активности с помощью оптогенетики с последующей заморозкой клеток в определенные моменты времени после стимуляции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии и клеточной биологии о механизмах рециркуляции синаптических везикул, а также, возможно, в моделировании в очень быстром масштабе времени. Основным преимуществом этого метода является возможность визуализации морфологических изменений в клетке с помощью электронной микроскопии в миллисекундном масштабе времени.

Процедуру продемонстрируют аспирант Шуо Ли и научный сотрудник Сумана Райчаудхури. Оба из моей лаборатории. Перед приготовлением фиксатора пометьте карандашом два миллилитровых криогенных файла в соответствии с их номерами образцов.

Затем соедините все фиксирующие реагенты и нанесите по одному миллилитру объема фиксатора в каждый флакон. После укупорки пробирок немедленно погрузите фиксаторы в жидкий азот и храните флаконы в закрытой коробке из пенополистирола. Далее заполните жидким азотом автоматическую установку свободной замены и морозильную камеру высокого давления.

Затем поместите небольшой контейнер с ацетоном в камеру для образцов установки для свободного замещения и подождите, пока температура установки замещения не достигнет минус 90 градусов по Цельсию. Чтобы запрограммировать протокол световой стимуляции, нажмите «Редактировать» в окне световой стимуляции сенсорного монитора. Откроется еще одно окно.

Введите 15 секунд для темновой фазы, 100 миллисекунд для периода, 10 миллисекунд для пульса и единицу для количества периодов для одного 10-миллисекундного стимула.

На главном экране убедитесь, что флажок для стимуляции света установлен, и нажмите «Хранилище образцов», а затем выберите «Редактировать». В новом окне с помощью кнопки «плюс» или «минус» выберите два образца для хранения двух образцов в каждом канале и подтвердите, что выбран параметр «Хранение жидкого азота» включено. Теперь под стереомикроскопом поместите ячейку сапфирового диска вверх в углубление средней черной пластины.

Далее следует распорное кольцо 100 микрон. Опустите одну сторону пустого сапфирового диска в предварительно подогретый солевой раствор и поместите диск на распорное кольцо солевой стороной вниз. Поместите еще одно распорное кольцо 100 микрон.

И распорное кольцо 400 микрон поверх последнего сапфирового диска и используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишнюю жидкость. Держа образцы в руках, убедитесь, что между сапфировыми дисками не застревают пузырьки воздуха. Затем поместите всю сборку между двумя прозрачными полуцилиндрами и закройте верхнюю красную крышку, чтобы начать процесс замораживания.

Красная крышка автоматически появится после завершения процесса заморозки. Когда все образцы будут заморожены, откройте дверцу дьюара для хранения и перенесите дьюар на столешницу. Перенесите камеру для образцов из накопительного дьюара в специализированный лоток для образцов, заполненный жидким азотом.

И разблокируйте ручку, чтобы освободить чашку для образцов. Затем с помощью пинцета с наконечниками, охлажденными жидким азотом, удалите прозрачные полуцилиндры из чашки для образца. И аккуратно переложите средние черные пластины в маленькую чашку, содержащую жидкий азот.

Следите за тем, чтобы замороженные образцы всегда находились под воздействием жидкого азота, и всегда обращайтесь с образцами с предварительно охлажденным пинцетом. Предварительно охладите пинцет еще раз, и быстро переложите первую среднюю пластину на предварительно охлажденный ацетон. Осторожно встряхивайте и постукивая по пластине, чтобы отделить сапфировый диск от пластины.

Затем поместите открытый криогенный файл фиксатора в камеру для образцов в узле замещения. Переложите сапфировый диск во флакон. И сразу же укупорьте флакон.

Когда все образцы будут перенесены, установите соответствующие параметры программы свободной замены и запустите программу. По окончании программы бесплатной замены используйте перчатки для переноса криогенных файлов из камеры для образцов в химический колпак и с помощью пипетки добавьте ацетон комнатной температуры в каждый флакон. Замените средство для промывки в каждом флаконе свежим ацетоном от четырех до шести раз в течение одного-двух часов.

Затем добавьте свежеприготовленную 30% эпоксидную смолу в каждый флакон для двух-трехчасовой инкубации при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 120 оборотах в минуту. В конце инкубации замените 30% эпоксидную смолу на 70% эпоксидную смолу для трех-четырехчасовой инкубации в орбитальном шейкере. Затем с помощью пинцета перенесите каждый диск клеткой вверх на крышку встраиваемой капсулы и добавьте 90% эпоксидной смолы на диски для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.

На следующее утро переложите каждый сапфировый диск в колпачок нового встраиваемого капсюля и заполните колпачок свежеприготовленной 100% эпоксидной смолой. После последней инкубации 100% эпоксидной смолой полимеризуйте образцы в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов. Когда образцы полимеризуются, поместите первый образец вверх ногами на стереомикроскоп так, чтобы сапфировый диск располагался в верхней части смоляного блока, и с помощью лезвия бритвы удалите тонкий слой смолы с верхней части образца.

Затем с помощью лезвия бритвы прорежьте неглубокую линию по краю диска, чтобы отделить сапфировый диск от эпоксидной смолы. И опустите диск в жидкий азот примерно на 10 секунд, чтобы отделить диск от остальной смолы. Перенесите смолу под препарирующий микроскоп и прикрепите образец к предметному столику микроскопа.

Используя увеличение от 4 до 10 раз, найдите область с ячейками и с помощью обоюдоострого лезвия бритвы разрежьте область два на два миллиметра вокруг интересующей области. Затем с помощью суперклея установите элементы на цилиндрический фиктивный блок из эпоксидной смолы и инкубируйте блок при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа. После среза на ультрамикротоме перенесите образцы в просвечивающий электронный микроскоп для визуализации с увеличением 930 000 раз.

На этом изображении показано слияние синаптических везикул посредством экзоцитоза, зарегистрированное через 15 миллисекунд после появления света в активной зоне пресинаптической мембраны в нейроне гиппокампа мыши. Через 100 миллисекунд после начала света можно наблюдать эндоцитозную яму, прилегающую к активной зоне, что иллюстрирует сверхбыстрый эндоцитоз нервной клеткой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обрабатывать образцы с помощью экспериментов со вспышкой и заморозкой.

Помните, что работа с глутаральдегидом, тетраоксидом осмия и жидким азотом может быть действительно опасной, поэтому убедитесь, что вы носите защитную одежду. После освоения замораживающая часть этой процедуры может быть выполнена за пару часов для 12 образцов, но остальные процедуры, включая визуализацию и анализ изображений, могут занять до дней, недель или даже месяцев, поэтому это может быть действительно долгая процедура. Если вы локализуете белки или визуализируете их динамику, вы также можете использовать различные протоколы для сохранения антигенности, или перламутровых, из перламутровых белков и визуализировать их динамику с помощью этих методов.