Glycoproteomics внеклеточного матрикса: Метод анализа интактного гликопептидных использованием масс-спектрометрии

Общая цель данного протокола заключается в анализе состава белков внеклеточного матрикса, включая идентификацию сайтов гликозилирования и композиционную характеристику форм гликанов в сердечно-сосудистых тканях. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о процессах фиброза тканей, например, о том, как гликозилирование структурного матрикса влияет на фиброз тканей при сердечно-сосудистых заболеваниях. Основным преимуществом данного метода является то, что, в отличие от предыдущих протоколов, анализирующих общие изменения гликозилирования, он позволяет охарактеризовать гликозилирование в конкретных сайтах структурных белков матрикса, предоставляя инструмент для более целевых последующих исследований механизмов.

Процедуры продемонстрируют доктор Марика Фава и госпожа Ферхин Байг из нашей лаборатории. Для начала процедуры подготовьте все экстракционные буферы согласно текстовому протоколу. Затем с помощью скальпеля измельчите 20–50 миллиграммов ткани на три или четыре фрагмента размером примерно два миллиметра.

Поместите измельченную ткань в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 500 мкл ледяного PBS. Промойте ткань пять раз, используя по 500 мкл PBS для каждой промывки, чтобы минимизировать загрязнение кровью. Перенесите промытые образцы в пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой и добавьте объем буфера хлорида натрия, в 10 раз превышающий вес ткани.

Перемешивайте на вортексе на минимальной скорости в течение одного часа при комнатной температуре. Затем перенесите экстракт в новые центрифужные пробирки и центрифугируйте при 16,000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Кратковременно промойте полученные осадки ткани свежим буфером на основе хлорида натрия.

После этого добавьте объем SDS-буфера, в 10 раз превышающий вес ткани, и перемешайте на вортексе на минимальной скорости в течение 16 часов при комнатной температуре. Перенесите экстракт в новые центрифужные пробирки и центрифугируйте при 16 000 ×g в течение 10 минут при температуре четырех °C. Промойте полученные осадки дважды дистиллированной водой.

Добавьте объем буфера гуанидингидрохлорида, в пять раз превышающий вес ткани, и перемешайте на вортексе на максимальной скорости в течение 72 часов при комнатной температуре. Перенесите полученный экстракт в новые пробирки и центрифугируйте при 16 000 ×g в течение 10 минут при температуре четырех градусов Celsius. После количественного определения белка отберите аликвоты по 10 µg в новые пробирки для каждого образца для оценки заполненности сайтов гликозилирования и по 50 µg в отдельные пробирки для прямого анализа гликопептидов.

Добавьте в каждую пробирку объем этанола, в 10 раз превышающий объем образца, и инкубируйте в течение ночи при 20 °C. На следующий день центрифугируйте образцы при 16 000 ×g в течение 30 минут при 4 °C. Аспирируйте супернатант, стараясь не задеть выпавший осадок.

Затем используйте вакуум-концентратор для высушивания осадка в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте 10 µL подготовленного буфера для дегликозилирования в каждый образец. Поместите пробирки с образцами в коническую пробирку объемом 50 mL и инкубируйте под углом 45° в течение двух часов при 25 °C.

После этого увеличьте температуру до 37 °C и инкубируйте в течение 36 часов при осторожном перемешивании. После центрифугирования при 16,000 ×g в течение одной минуты используйте вакуум-концентратор при комнатной температуре в течение 45 минут для выпаривания воды. Ресуспендируйте высушенные образцы в 10 µL воды, меченной O-18, содержащей 50 U/mL PNGase F. Инкубируйте в течение 36 часов при 37 °C при постоянном перемешивании, затем проведите trypсин-переваривание всех образцов в растворе и перейдите к очистке на C-18.

Для начала добавьте 200 µL метанола в каждую лунку спин-пластины C-18 для активации смолы. Центрифугируйте при 1 000 ×g в течение одной минуты. Затем добавьте в каждую лунку 200 µL 80% ACN и 0,1% TFA в воде и центрифугируйте при 1 000 ×g в течение одной минуты.

Затем в каждую лунку добавьте 200 µL раствора, содержащего 1% ACN и 0,1% TFA в воде, и центрифугируйте в течение одной минуты при 1 000 ×g. Повторите добавление данного раствора и центрифугирование дважды. После этого внесите образцы в лунки спин-пластины и центрифугируйте при 1500 ×g в течение одной минуты. Повторно внесите фильтрат и повторите центрифугирование.

Затем добавьте в каждую лунку по 200 µL раствора, содержащего 1% ACN и 0,1% TFA в воде, и центрифугируйте при 1500 ×g в течение одной минуты. Повторите добавление данного раствора и центрифугирование дважды. Далее добавьте в каждую лунку по 170 µL раствора, содержащего 50% ACN и 0,1% TFA в воде, и центрифугируйте при 1500 ×g в течение одной минуты.

Повторите процедуру добавления и центрифугирования еще раз. Используйте вакуум-концентратор для высушивания объединенного элюата при комнатной температуре в течение двух часов. Храните высушенные образцы при 80 °C до начала использования.

После этого проведите анализ образцов, предназначенных для оценки заполненности гликозитов, методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией. Для образцов, предназначенных для прямого анализа гликопептидов, сначала выполните стандартное мечение TMT zero, как описано в текстовом протоколе. Для начала добавьте к каждым 10 µL образца с меткой TMT zero 50 µL прилагаемого связывающего буфера.

Затем перенесите по 50 µL гомогенизированной суспензии глико-захватывающей смолы в новые пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте в течение одной минуты при 2500 ×g. Удалите супернатант и с помощью пипетки добавьте в пробирки с осадками смолы 60 µL смеси образца и связывающего буфера, перемешивая. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут при перемешивании со скоростью 1200 об/мин. После центрифугирования в течение двух минут при 2 000 ×g перенесите супернатант в новые пробирки.

После этого с помощью пипетки добавьте по 150 µL промывочного буфера в каждую пробирку с смолой, перемешайте и начните процесс промывки. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут при перемешивании со скоростью 1200 RPM. После центрифугирования при 2500 ×g в течение двух минут перенесите каждый супернатант в соответствующую пробирку для хранения супернатантов, чтобы завершить промывку.

Повторите этот процесс промывки еще два раза. Затем добавьте 75 µL элюирующего буфера и перемешайте с помощью пипетки. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут при перемешивании со скоростью 1200 RPM.

Центрифугируйте при 2500 ×g в течение двух минут и перенесите каждый супернатант в новую пробирку объемом 1,5 мл. С помощью пипетки добавьте 75 µL элюирующего буфера для перемешивания, затем повторите инкубацию и центрифугирование образцов. Перенесите каждый элюат в соответствующую пробирку.

После центрифугирования объединенного элюата в течение двух минут при 2500 ×g перенесите каждый супернатант в новую пробирку, чтобы полностью удалить смолу. После этого используйте вакуум-концентратор для высушивания элюата в течение двух часов при комнатной температуре. Ресуспендируйте высушенные гликопептиды в 15 µL 2%ACN и 0,5%TFA в дважды дистиллированной воде.

Затем проведите масс-спектрометрический анализ согласно текстовому протоколу. В данном исследовании белки внеклеточного матрикса (ВКМ) из сердечно-сосудистой ткани подготавливаются для анализа состава ВКМ методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, а также для косвенного и прямого анализа гликопептидов. Основная стратегия основана на последовательном инкубировании с хлоридом натрия, SDS и гуанидингидрохлоридом с последующим косвенным или прямым анализом гликопептидов.

Эффективность экстракции контролируют на бис-трис акриламидных гелях с использованием окрашивания серебром для визуализации. Из трех нанесенных экстрактов большинство гликопротеинов ВКМ наблюдается в аликвотах с гуанидингидрохлоридом. Гликопротеины ВКМ содержат длинные повторяющиеся цепи гликозаминогликанов, а также короткие разнообразные N- и O-связанные олигосахариды.

Эффективность дегликозилирования оценивают путем добавления ферментов, расщепляющих гликозаминовые гликаны, и ферментов, нацеленных на более короткие N- и O-связанные олигосахариды. Гликопротеины затем идентифицируют по наличию деамидированных остатков аспарагина, меченных кислородом 18 в секвонах NXT или NXS. Здесь представлен репрезентативный тандемный масс-спектр HCD для пептида декорина с деамидированным аспарагином в положении два 11.

Затем для анализа обогащенного гликопротеинами экстракта ВКМ используется фрагментация HCD ETD. Тандемный масс-спектр ETD позволяет определить состав гликанов. После освоения данной методики ее выполнение будет занимать примерно от двух до трех недель.

Данный гликопротеомный анализ позволяет нам изучать физиологию и патологию фиброза, основываясь не только на изменениях протеома, но и на составе связанных с белками сахаров. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать образцы для исследования гликозилирования белков методом масс-спектрометрии. Хотя этот метод позволяет получить данные о сердечно-сосудистых заболеваниях, он также может быть применен к другим патологиям, сопровождающимся фиброзом, таким как респираторные заболевания или рак.