Glycoproteomics внеклеточного матрикса: Метод анализа интактного гликопептидных использованием масс-спектрометрии

Общей целью данного протокола является анализ белкового состава внеклеточного матрикса, включая идентификацию сайтов гликозилирования и характеристику состава форм гликанов в сердечно-сосудистых тканях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в процессе фиброза тканей, например, как гликострация структурного матрикса влияет на фиброз тканей при сердечно-сосудистых заболеваниях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в отличие от предыдущих протоколов, которые анализируют общие изменения гликозилирования, он позволяет охарактеризовать гликозилирование в определенных участках белков структурного матрикса, предоставляя инструмент для более целенаправленных последующих механистических исследований.

Демонстрировать процедуры будут д-р Марика Фава и г-жа Ферхин Байг из нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте все буферы извлечения, как указано в текстовом протоколе. Затем с помощью скальпеля нарежьте от 20 до 50 миллиграммов ткани на три или четыре меньших кусочка размером около двух миллиметров.

Поместите нарезанную кубиками ткань в пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 500 микролитров ледяного PBS. Промойте салфетку пять раз, используя 500 микролитров PBS для каждого мытья, чтобы свести к минимуму загрязнение крови. Переложите промытые образцы в пробирку объемом 1,5 миллилитра с завинчивающейся крышкой и добавьте объем буфера хлорида натрия, в 10 раз превышающий вес ткани.

Вихрь на минимальной скорости в течение одного часа при комнатной температуре. Затем перенесите экстракт в новые центрифужные пробирки и центрифугуйте при 16 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Коротко промойте образовавшуюся ткань гранулами со свежим буфером хлорида натрия.

После этого добавьте объем буфера SDS в 10 раз больше веса ткани и сделайте вихрь с минимальной скоростью в течение 16 часов при комнатной температуре. Переложите экстракт в новые центрифужные пробирки и центрифугу при температуре 16 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Полученные гранулы промыть двойной дистиллированной водой.

Добавьте объем буфера гуанидина гидрохлорида, в пять раз превышающий вес ткани, и сделайте вихрь на максимальной скорости в течение 72 часов при комнатной температуре. Полученный экстракт переложите в новые пробирки и центрифугируйте при 16 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После количественного определения белка аликвота 10 мкг в новую пробирку для каждого образца для оценки занятости сайта гликозилирования и 50 мкг в отдельную пробирку для прямого анализа гликопептидов.

Добавьте в каждый из них в 10 раз больше объема этанола и инкубируйте в течение ночи при температуре 20 градусов Цельсия. На следующий день центрифугируйте образцы при 16 000 умноженных на G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить выпавшие в осадок гранулы.

Затем с помощью вакуумного концентратора высушите гранулы в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте в каждый образец по 10 микролитров приготовленного буфера для дегликозилирования. Упакуйте пробирки с образцами в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и инкубируйте под углом 45 градусов в течение двух часов при температуре 25 градусов Цельсия.

После этого увеличьте температуру до 37 градусов по Цельсию и выдерживайте в течение 36 часов при слабом помешивании. После центрифугирования при 16 000 G в течение одной минуты используйте вакуумный концентратор при комнатной температуре в течение 45 минут для испарения воды. Повторно суспендируйте высушенные образцы 10 микролитрами воды, меченной O-18, содержащей 50 единиц на миллилитр PNGase F. Инкубируйте в течение 36 часов при 37 градусах Цельсия при постоянном перемешивании, затем выполните расщепление трипсина в растворе для всех образцов и приступайте к очистке C-18.

Для начала добавьте по 200 микролитров метанола в каждую лунку спиновой пластины C-18, чтобы активировать смолу. Центрифугируйте при 1000 умноженных на G в течение одной минуты. Затем добавьте 200 микролитров 80% ACN и 0,1% TFA в воду в каждую лунку и центрифугируйте при 1000 G в течение одной минуты.

Далее добавьте в каждую лунку по 200 микролитров раствора, содержащего 1% ACN и 0,1% TFA в воде, и центрифугируйте в течение одной минуты при 1000 раз G. Повторите добавление этого раствора и центрифугирование дважды. После этого загрузите образцы в лунки спин-планшета и центрифугируйте при 1500-кратном G в течение одной минуты. Перезагрузите поток и повторите центрифугирование.

Затем добавьте 200 микролитров раствора, содержащего 1% ACN и 0,1% TFA в воде, в каждую лунку и центрифугируйте при 1500 G в течение одной минуты. Повторите добавление этого раствора и центрифугирование дважды. Затем добавьте в каждую лунку 170 микролитров раствора, содержащего 50% ACN и 0,1% TFA в воде и центрифугируйте при 1500 G в течение одной минуты.

Повторите это добавление и центрифугирование еще раз. С помощью вакуумного концентратора высушите комбинированный элюй при комнатной температуре в течение двух часов. Храните высушенные образцы при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

После этого проводят тандемный масс-спектрометрический анализ жидкостной хроматографии образцов, предназначенных для оценки занятости гликозитов. Для образцов, предназначенных для прямого анализа гликопептидов, сначала следует использовать стандартную нулевую маркировку TMT, как указано в текстовом протоколе. Для начала добавьте в каждые 10 микролитров нулевого меченого образца 50 микролитров прилагаемого связывающего буфера.

Затем добавьте 50 микролитров гомогенной суспензии гликозахватной смолы в новые пробирки объемом 1,5 миллилитров и центрифугируйте в течение одной минуты при температуре 2500 °G. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 60 микролитров образца и связующего буферного раствора в пробирки, содержащие гранулы смолы, с помощью пипетки перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, перемешивая при 1200 об/мин. После центрифугирования в течение двух минут при 2000 G переведите надосадочную жидкость в новые пробирки.

После этого добавьте 150 микролитров буфера для промывки в каждую пробирку со смолой с помощью пипетки для смешивания, чтобы начать процесс промывки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, перемешивая при 1200 об/мин. После центрифугирования при 2500 G в течение двух минут перенесите каждую надосадочную жидкость в соответствующую пробирку для хранения надосадочной жидкости для завершения промывки.

Повторите этот процесс стирки еще два раза. Далее добавьте 75 микролитров элюирующего буфера и перемешайте пипеткой. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут, перемешивая при 1200 об/мин.

Центрифугируйте при 2500 умноженных на G в течение двух минут и переложите каждую надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 75 микролитров элюирующего буфера с помощью пипетки для смешивания, а затем повторите инкубацию и центрифугирование образцов. Переложите каждый элют в соответствующую трубку.

После центрифугирования комбинированного элюя в течение двух минут при 2500 G переведите каждую надосадочную жидкость в новую пробирку, чтобы обеспечить полное удаление смолы. После этого с помощью вакуумного концентратора высушите элюй в течение двух часов при комнатной температуре. Ресуспендируйте высушенные гликопептиды в 15 микролитрах 2% ACN и 05% TFA в воде двойной дистилляции.

Затем выполните масс-спектрометрический анализ, как указано в текстовом протоколе. В данном исследовании белки ВКМ из сердечно-сосудистой ткани были подготовлены для жидкостной хроматографии, тандемного масс-спектрометрического анализа состава ВКМ, а также для анализа непрямых и прямых гликопептидов. Основная стратегия основана на последовательной инкубации с хлоридом натрия, SDS и гидрохлоридом гуанадина с последующим непрямым или прямым анализом гликопептида.

Эффективность экстракции контролируется на бис-трис акриламидных гелях с серебряным окрашиванием для визуализации. Из трех экстрактов большая часть гликопротеинов ECM содержится в аликвотах гидрохлорида гуанадина. Гликопротеины ECM украшены большими и повторяющимися цепями гликозамина, а также короткими и разнообразными N и O-связанными олигосахаридами.

Эффективность дегликозилирования проявляется при добавлении ферментов, которые расщепляют гликозаминовые гликаны, и ферментов, нацеленных на более мелкие N и O-связанные олигосахариды. Затем гликопротеины идентифицируются по присутствию дезамидированных аспарагинов, меченных кислородом 18, в секвонах NXT или NXS. Здесь показан репрезентативный тандемный масс-спектр HCD для пептида декорина с дезамидированным аспарагином в положении 2 11.

Затем фрагментация HCD ETD используется для анализа обогащенного гликопротеином экстракта ECM. Тандемный масс-спектр ETD позволяет характеризировать состав гликанов. После освоения этой техники должно уйти примерно две-три недели.

Такая гликопротеомика позволяет исследовать физиологическую и патологическую функцию фиброза не только по изменению протеомики, но и по составу мысленных сахаров. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить образцы для исследования гликозилирования белка методом масс-спектрометрии. Хотя этот метод может дать представление о сердечно-сосудистых заболеваниях, он также может быть применен при других патологиях объемного фиброза, таких как респираторные заболевания или рак.