Смешанные первичные культуры мышиных тонкой кишки, предназначенные для изучения Gut Гормон Секреции и живых изображений клеток из клеток энтероэндокринных

Общая цель этого метода заключается в выделении и культивировании смешанных клеток кишечника мышей, чтобы можно было изучать секрецию пептидов кишечника и визуализацию энтероэндокринных клеток в живых клетках. Первоначально мы разработали этот метод для возможности определения характеристик энтероэндокринных клеток in vitro. Энтероэндокринные клетки контролируют содержимое кишечника и регулируют гомеостаз организма.

Но их было трудно изучать, так как они разбросаны по всему эпителию кишечника. Описанные здесь кальцисы особенно полезны в сочетании с генетическим флуоресцентным мечением энтероэндокринных клеток, поскольку это позволяет использовать методы электрофизиологической и визуализации живых клеток отдельных клеток. Демонстрировать процедуру будет Шерил Брайтон, послеоперационная в нашей лаборатории.

Для начала перенесите изолированную двенадцатиперстную кишку мыши в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную PBS. С помощью щипцов аккуратно захватите один конец кишечного фрагмента, и введите кончик пастеровской пипетки в его просвет. Затем промойте содержимое кишечника охлажденным PBS.

Повторите для обоих концов кишечника до тех пор, пока большая часть содержимого не будет удалена. Переложите промытый кишечник в чистую чашку Петри, наполненную свежим охлажденным PBS. Под рассекающим микроскопом удалите любые жировые ткани и брыжейку из фрагмента кишечника, не допуская при этом оттягивания мышечного слоя.

Затем определите лоскут мышечного слоя на проксимальном конце ткани. Затем, используя два набора тонких форцепсов, осторожно оттяните небольшое количество слоя по всему кишечнику. Возьмитесь за кишечник и как можно большую часть мышечного лоскута, затем осторожно раздвиньте слои и начните отслаивать мышечный слой вокруг кишечника.

Держите щипцы близко друг к другу, чтобы предотвратить разрыв мышечного слоя и эпителия. Удалите мышечный слой со всей длины кишечного фрагмента. После этого вскройте кишечник, разрезав его в продольном направлении, и переложите его в чистую чашку Петри, содержащую свежеохлажденный PBS.

Взбалтывайте ткань, чтобы смыть ее от остатков колокольчика или слизи. После того, как он будет промыт, разрежьте ткань лезвием хирургического скальпеля, чтобы получить квадраты размером примерно один-два квадратных миллиметра. Затем с помощью предварительно смоченной пастеровской пипетки с предварительно отрезанным наконечником перенесите полученные фрагменты в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, заполненную примерно 20 миллилитровыми охлажденными PBS.

Аккуратно встряхните трубку, чтобы дополнительно промыть фрагменты ткани, и дайте ткани отстояться. Как только ткань осядет, отсадите большую часть PBS и промойте образец свежим PBS еще раз. Чтобы переварить кишечник, используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, чтобы перенести фрагменты ткани в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую охлажденный стерильный DMEM, взболтать суспензию, дать ткани осесть, а затем удалить среду.

Добавьте 7 миллилитров пищеварительной среды к фрагментам тканей и взболтайте суспензию. Выдержать суспензию на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации осторожно встряхивайте трубку в течение примерно трех секунд.

Отложите непереваренную ткань и переложите среду для сбраживания в центрифугу объемом 15 миллилитров. Дайте случайно собранной ткани осесть и с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров перенесите ее обратно в центрифугу объемом 15 миллилитров, содержащую непереваренную ткань. Сохраните небольшой объем среды для пищеварения для микроскопического наблюдения и выбросьте остатки.

Следите за содержимым среды для сбраживания под световым микроскопом, чтобы убедиться, что суспензия не содержит много крипт. Далее добавьте 7 миллилитров свежей среды для варивания, и проведите процедуру пищеварения еще раз. Для приготовления суспензии фрагментов крипты добавьте в фрагменты кишечника 7 миллилитров свежей среды для пищеварения.

Инкубируйте ткань в воде при температуре 37 градусов Цельсия в течение десяти минут. Встряхивайте образец дольше и энергичнее, на этот раз каждые пять минут. Отложите непереваренную ткань и переложите среду для сбраживания в центрифугу объемом 15 миллилитров.

Дайте случайно собранной ткани осесть и с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров перенесите ее обратно в центрифугу объемом 50 миллилитров, содержащую непереваренную ткань. Добавьте к фрагментам кишечника 7 миллилитров свежей пищеварительной среды, и приступайте к следующему варочному перевариванию. Затем центрифугируйте среду, собранную из предыдущего вареста, при 100 х г при комнатной температуре в течение 3 минут.

После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 миллилитрах предварительно подогретой питательной среды, путем щадящего пипетирования. Затем отложите образец в сторону и соберите небольшую аликвоту клеточной суспензии. Под световым микроскопом убедитесь, что образец содержит изолированные фрагменты крипты.

Повторите переваривание ткани еще 2-3 раза или до тех пор, пока большая часть ткани не будет переварена. После того, как надосадочная жидкость будет собрана, объедините их все и центрифугируйте образец при 100x g при температуре toom в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу путем аккуратного пипетирования, пока не исчезнут комки, и добавьте 5 миллилитров предварительно подогретой питательной среды с добавлением 10 микромолей Y-27632, что предотвращает анойкис.

Наконец, отфильтруйте клеточную суспензию через фильтр 100 микрон, чтобы удалить любую непереваренную ткань. Промойте фильтр еще 2 миллилитрами предварительно подогретой питательной среды с добавлением Y-27632. Перед посевом клеток извлеките из инкубатора пластину, покрытую базальной мембранной матрицей.

Излишки раствора базальной мембранной матрицы снимите с плиты, и добавьте в каждую лунку по 250 микролитров предварительно подогретой питательной среды, дополненной 10 микромолярами Y-27632. Засейте по 250 мкл клеточной суспензии в лунку 24-луночного планшета, путем капельного пипетирования проводят медленным зигзагообразным движением. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Здесь представлены микроскопические изображения монослоев первичных клеток тонкой кишки, полученные через 18–24 часа после посева. Первичные клетки тонкого кишечника, которые культивировались in vitro, реагировали на стимулы, повышающие внутриклеточный кальций, или циклический АМФ, что приводило к двукратному увеличению высвобождения глюкагоноподобного пептида-1 при обработке клеток бомбезином и одиннадцатикратному усилению секреции при одновременной стимуляции форсколином и IBMX. Наконец, с использованием культур, полученных от трансгенных мышей, экспрессирующих GCAMP 3 под контролем про-глюкагонового промотора, было показано, что первичные L-клетки тонкого кишечника реагируют на стимуляцию бомбезином и хлоридом калия увеличением цитозольного кальция, о чем свидетельствует усиленная флуоресценция.

Продемонстрированная процедура ориентирована на культивальные клетки тонкого кишечника, что для многих исследователей оказалось сложной задачей. Мы также используем аналогичную методику для культивирования других сегментов кишечника, как мышиного, так и человеческого происхождения. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

Не бывает двух одинаковых препаратов, поэтому важно не забывать осматривать аликвоты каждого диджеста под микроскопом. Это позволяет оценить прогресс и соответствующим образом настроить интенсивность встряхивания и количество перевариваний.