Выделение мышиных полученных из жировой ткани микрососудистых Фрагментов как васкуляризация единицы для тканевой инженерии
30 апреля 2017 г.
Мы представляем протокол для выделения полученных из жировой ткани фрагменты микрососудистой, которые представляют собой перспективные единицы васкуляризации. Они могут быть быстро изолированы, не требуют обработки в лабораторных условиях и, таким образом, могут быть использованы для одностадийного prevascularization в различных областях тканевой инженерии.
Общая цель этой процедуры заключается в выделении микрососудистых фрагментов из жировой ткани мышей для создания единиц васкуляризации для тканевой инженерии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии о васкуляризации тканевых заменителей in vivo. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получить полностью функциональные микрососудистые сегменты без сложной обработки in vitro, которые могут быть засеяны на каркасы и имплантированы в дефекты тканей.
Этот метод также может быть применен к другим системам, таким как анализы ангиогенеза in vitro, чтобы раскрыть молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования и ремоделирования микрососудистых сетей. Начните с помещения под наркоз самца мыши типа C57 black six в лежачем положении под хирургическим стереомикроскопом и подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги. Обездвижьте лапы лентой и продезинфицируйте живот.
Далее с помощью препарирующих ножниц отделите брюшной слой от подлежащей мышечной ткани и сделайте срединную лапаротомию. Латерально разверните лоскуты брюшной стенки и двусторонне определите яички, придатки яичка и придатковые жировые пакеты. Затем используйте небольшие ножницы для подготовки и тонкие щипцы для сбора жировых пакетов, стараясь не собирать ткань придатка яичка, и поместите жировые пакеты в чашку Петри, содержащую 15 мл 37 градусов Цельсия DMEM.
В вытяжке с ламинарным потоком вымойте жировые прокладки в трех отдельных чашках Петри, содержащих 15 мл PBS, и поместите промытый жир в пустую полипропиленовую трубку объемом 14 мл. Используйте трубчатые весы, чтобы определить объем собранного жира. Затем с помощью тонких ножниц механически измельчите жировую ткань.
Когда получена однородная тканевая суспензия, с помощью мерной пипетки объемом 10 мл переложите измельченную салфетку с двумя объемами коллагиназы NB 4G в колбу Эрленмейера объемом 50 мл, содержащую 25-миллиметровый стержень для перемешивания. Поместите колбу в инкубатор для клеточных культур на 10 минут при энергичном помешивании. Затем рассмотрите 10 мкл переваренной ткани под микроскопом.
Самым сложным этапом в этой процедуре изоляции является определение подходящего времени для остановки пищеварения. Слишком долгое переваривание жировых пакетов приведет к образованию одноклеточной суспензии без микрососудистых фрагментов. Если дигестат содержит свободные микрососудистые фрагменты, полученные из жировой ткани, рядом с одиночными клетками, нейтрализуйте фермент двумя объемами PBS с добавлением 20% FCS и перенесите суспензию клеточного сосуда в новые полипропиленовые трубки.
Инкубируйте раствор в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы отделить фрагменты микрососудов от оставшегося жира под действием силы тяжести. Затем с помощью точной пипетки объемом 1 мл осторожно удалите один мл основного жирового надосадочного слоя, а затем с помощью прецизионной пипетки объемом 100 мкл удалите оставшуюся надосадочную жидкость до тех пор, пока суспензия не станет обезжиренной. Когда весь жир будет удален, с помощью мерной пипетки объемом 10 мл отфильтруйте суспензию клеточного сосуда через ситечко размером 50 микрон через коническую трубку объемом 50 мл и переложите отфильтрованную суспензию в новую полипропиленовую трубку объемом 14 мл для каждого отдельного изолята микрососудистого фрагмента.
Соберите гранулы микрососудистых фрагментов центрифугированием и удалите все мл надосадочной жидкости, кроме последнего, из каждой пробирки. Повторно суспендируйте гранулы в оставшихся надосадочных слоях. Затем переложите каждую суспензию в отдельные конические микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и снова гранулируйте микрососудистые фрагменты для повторного взвешивания в соответствующем конечном объеме PBS и 20% FCS для запланированного последующего анализа.
Здесь показано распределение по длине свежевыделенных микрососудистых фрагментов от шести, семи- и двенадцатимесячных черных шестимесячных мышей дикого типа C57, со средней длиной около 42 микрометров. Как показывает этот репрезентативный мазок суспензии клеточных сосудов, при достаточном переваривании жировой ткани наблюдаются крупные, средние и мелкие микрососудистые фрагменты, а также отдельные клетки. Более высокое увеличение показывает, что микрососудистые фрагменты демонстрируют зрелую морфологию микрососудов с иерархическими сегментами микрососудов.
Характеристика микрососудистых фрагментов с помощью проточной цитометрии указывает на то, что они содержат CD31-положительные эндотелиальные клетки, альфа-альфа-актон-позитивные мезенхимальные стволовые клетки и CD117-положительные мезенхимальные стволовые клетки, маркеры-экспрессирующие клетки. После посева на кожный заменитель кожи более крупные микрососудистые фрагменты в основном локализуются на поверхности имплантата, при этом некоторые сегменты капиллярных сосудов обнаруживаются внутри ядер имплантатов. Иммуногистохимическое окрашивание засеянных микрососудистых фрагментов дополнительно выявляет физиологические конфигурации микрососудов с артериолярными, венулярными и капилляроподобными фрагментами.
После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить микрососудистые фрагменты из жировой ткани мыши в качестве единиц васкуляризации для тканевой инженерии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод выделения фрагментов микрососудов из жировой ткани, которые служат эффективными единицами васкуляризации. Метод позволяет осуществлять быстрое выделение без необходимости обработки in vitro, что делает его подходящим для одноэтапной преваскуляризации в задачах тканевой инженерии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Биология микрососудов
- Методы васкуляризации
Теоретические сведения
- Микрососудистые фрагменты имеют решающее значение для понимания васкуляризации тканей.
- Современные методы часто требуют сложной обработки in vitro.
- Данное исследование сосредоточено на методе, упрощающем процесс изоляции.
- Функциональные микрососудистые сегменты необходимы для эффективной тканевой инженерии.
Цель исследования
- Для выделения фрагментов микрососудов из жировой ткани мыши.
- Для создания единиц васкуляризации для тканевой инженерии.
- Для обеспечения васкуляризации тканевых заменителей in vivo.
Используемые методы
- Выделение фрагментов микрососудов из анестезированных мышей.
- Использование хирургического стереомикроскопа для обеспечения точности.
- Подтверждение анестезии по отсутствию реакции на раздражители.
- Применение фрагментов в скаффолдах для имплантации.
Основные результаты
- Успешная изоляция полностью функциональных сегментов микрососудов.
- Фрагменты могут быть высеяны на скаффолды для восполнения тканевых дефектов.
- Метод применим для анализов ангиогенеза in vitro.
- Понимание молекулярных механизмов формирования микрососудистой сети.
Выводы
- Данный протокол представляет собой простой метод выделения фрагментов микрососудов.
- Он расширяет возможности эффективной преваскуляризации в тканевой инженерии.
- Этот метод может способствовать развитию исследований в области биологии сосудов и тканевой инженерии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Выделение функциональных микрососудистых фрагментов из жировой ткани позволяет устранить критический барьер в тканевой инженерии: необходимость в быстром и надежном васкуляризировании инженерных конструктов без длительного созревания in vitro. Данный подход делает возможными стратегии одноэтапной преваскуляризации, которые улучшают выживаемость и интеграцию конструкта после имплантации, напрямую способствуя снижению рисков при терапии тканей, зависящих от кровоснабжения. Этот метод обеспечивает масштабируемый и воспроизводимый источник сосудистых единиц с собственным содержанием мезенхимальных стволовых клеток, что повышает прогностическую достоверность результатов преклинической васкуляризации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать вклад сосудистой ниши в регенерацию тканей и взаимодействие стромальных клеток в инженерных микросредах.
- Практическая ценность: Предоставляет стандартизированную, количественно определяемую сосудистую единицу для функциональной валидации проангиогенных мишеней в рабочих процессах по поиску новых лекарственных средств.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Способствует разработке воспроизводимых методов анализа ангиогенеза in vitro с использованием изолированных микрососудистых фрагментов для оценки влияния соединений на формирование и стабильность сети.
- Практическая ценность: Обеспечивает единообразную морфологию микрососудов и распределение их длины (среднее значение ~42 µm) для стандартизации анализа в различных лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует in vivo повторную сборку в иерархические сети микрососудов (артериолярные, венулярные, капилляроподобные) после имплантации, подтверждая функциональность сосудов в моделях, релевантных для заболеваний.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять быстрый посев на каркасы (например, заменители кости или кожи) для ускоренной доклинической оценки васкуляризированных тканевых конструктов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Изолированные фрагменты микрососудов функционируют как технология, обеспечивающая переход от этапа поиска к доклиническим исследованиям, что позволяет проводить раннюю валидацию сосудистой сети перед оптимизацией ведущих соединений и обосновывать решения о целесообразности дальнейшей разработки на основе потенциала васкуляризации в тканеинженерных системах.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез об ангиогенных и лимфангиогенных путях, используя фрагменты, содержащие клетки CD31+, α-SMA+ и CD117+, в качестве нативного сосудистого индикатора.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных сосудистых единиц с количественно определяемой морфологией для высокоточного скрининга соединений в анализах на ангиогенез и васкулогенез.
- Аналитика: предоставляет данные проточной цитометрии и иммуногистохимического анализа (CD31, α-SMA, CD117) для количественной оценки вклада эндотелиальных, периваскулярных и мезенхимальных стволовых клеток в формирование сосудистой сети.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от изоляции фрагментов до восстановления сосудистой сети in vivo, что позволяет проводить доклиническую оценку интеграции и перфузии конструкта.
- Повторное использование в организации: устанавливает воспроизводимый протокол изоляции, применимый к различным типам тканей (кость, кожа) и моделям, что снижает затраты на повторную разработку рабочих процессов васкуляризации.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность в исследованиях васкуляризации, обеспечивая получение нативных микрососудистых сегментов с сохранными периваскулярными компартментами и стволовыми клетками.
- Практическая ценность: Позволяет проводить изоляцию менее чем за два часа с использованием минимального оборудования (хирургического стереомикроскопа, центрифуги, фильтра), что способствует стандартизации процесса в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет ранней валидации способности к васкуляризации, что снижает риск неудач на поздних этапах из-за плохой интеграции конструкции.
- Влияние на портфель разработок: Способствует приоритизации методов терапии васкуляризированных тканей с учетом рисков, предоставляя ранние прогностические данные о васкуляризации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в диссекции тканей мыши и оптимизации ферментативного переваривания, чтобы избежать избыточной обработки до состояния суспензии отдельных клеток.
- Зависит от наличия коллагеназы NB 4G, стерильных культуральных инкубаторов и точности дозирования при выполнении этапов фракционирования и фильтрации.
- Необходимы стандартизированные протоколы нейтрализации и промывки (PBS + 20% FCS) для выделения осадков безжировых микрососудистых фрагментов.
- При масштабировании исследований необходимо учитывать влияние возраста донора (6–12 месяцев) на выход и морфологию фрагментов.
- Ограничено необходимостью немедленного использования или краткосрочного хранения в PBS/FCS для сохранения целостности фрагментов и функциональности сосудов.
