Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и ассоциации нейронной ткани E17 мыши, чтобы культивировать, записывать и стимулировать нейронные сети на микроэлектродных решетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении сетевой динамики, так как они касаются основных механизмов обучения и памяти. Основное преимущество этого метода заключается в том, что микроэлектродные матрицы могут вести запись с нескольких участков одновременно и, следовательно, могут обеспечить лучшее пространственное временное разрешение по сравнению с более традиционной стеклянной пипеткой на одном участке

Хотя этот метод может дать представление о сетевой динамике обучения и памяти, он также может быть использован для исследования токсичности лекарств или разработки парадигм для персонализированной медицины следующего поколения. Визуальная демонстрация этого процесса имеет решающее значение, так как манипуляции с тканями во время процесса рассечения и диссоциации трудно освоить, просто читая протоколы. Чтобы приготовить матрицу, добавьте от 40 до 50 микролитров размороженного ламинина в центр каждого МЭА и 0,2 миллилитра ламинина в контрольные пластины, используя стерильные наконечники для пипеток.

Накройте все MEA и контрольные чашки в биовытяжке и перенесите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Через час осторожно удалите избыток ламинина из центра МЭА с помощью отсасывания с помощью стерильных пипеток Пастера и дайте поверхности высохнуть на воздухе перед нанесением покрытия. Затем налейте среду L-15 в четыре 100-миллиметровые чашки Петри, накройте их крышками и поместите в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов Цельсия примерно на 40-60 минут, пока среда не приобретет слякотную консистенцию, но не замерзнет в твердом виде.

Чтобы подготовиться к вскрытию, поместите стеклянную чашку Петри лицевой стороной вниз в поднос, наполненный льдом. Теперь опрыскайте нижнюю часть живота животного 70%-ным этанолом. С помощью небольших хирургических ножниц сделайте V-образный надрез через кожу и подкожно-жировую клетчатку нижней части живота, расширяя разрез до дистальных концов грудной полости, и обнажая матку.

С помощью щипцов аккуратно приподнимают матку между эмбрионами. Разрежьте соединительную ткань ножницами для рассечения до тех пор, пока вся матка не освободится. Затем кратко промойте матку 70% этанолом, чтобы удалить кровь, и поместите ее в одну из четырех чашек Петри, наполненных холодным L-15.

Впоследствии освободите каждый эмбрион от матки и внутреннего эмбрионального мешка, используя две пары щипцов с тонкими наконечниками. Поместите освобожденные эмбрионы во вторую чашку, наполненную холодным L-15, затем перенесите головы в третью чашку Петри, а тела в четвертую. В биоколпаке положите клин автоклавной фильтровальной бумаги на охлажденную стеклянную ступень чашки Петри и поместите одну головку эмбриона на фильтровальную бумагу.

Затем поместите режущий край нижнего ножницы радужной оболочки в основание черепа, удерживая нижний ножницы у внутренней поверхности черепа и подальше от мозга, прорежьте затылочную пластинку, а затем по средней линии между теменными пластинками. Продолжайте резать рострально между хрящевыми лобными пластинами черепа. Затем, начиная с центра затылочной пластины, сделайте перпендикулярный срез слева и справа от центрального среза.

После этого осторожно проведите небольшим шпателем между вентральной поверхностью мозга и нижними пластинами черепа, пока он полностью не окажется под мозгом. Затем поднимите шпатель вверх, чтобы удалить мозг. С помощью чистого шпателя сначала удалите обонятельную луковицу, затем рассеките лобную долю по трапециевидной схеме.

Затем перенесите ткань в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую среду для хранения. В этой процедуре используйте два стерильных лезвия скальпеля, чтобы измельчить ткань. Затем добавьте 2,5 миллилитра папаинистской смеси Dnase в измельченную ткань в чашке Петри.

Аккуратно покрутите чашку Петри, чтобы убедиться, что вся ткань свободна в растворе, а не прилипла ко дну чашки. После этого поместите блюдо в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. В биокапюшоне используйте стерильную переносную пипетку с широким отверстием, чтобы перенести все среды и ткани в стерильную криогенную пробирку объемом пять миллилитров.

Поместите кончик той же переводной пипетки близко ко дну пробирки и осторожно взбейте смесь 10-15 раз. Затем добавьте два миллилитра подогретого DMEM 5/5 в диссоциированную клеточную смесь, и закупорьте пробирку центрифуги. Аккуратно перемешайте с помощью инверсии и центрифугируйте при 573 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

В биовытяжке выбросьте всю надосадочную жидкость, не нарушая поддон. Впоследствии добавьте один миллилитр подогретого DMEM 5/5 в поддон в трубке для ресуспендирования клеток. Используйте стерильную переводную пипетку малого диаметра, чтобы разбить поддон, осторожно проводя трубопроводами вверх и вниз до однородной массы.

Затем переложите 10 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Вне биоколюшата добавьте 10 микролитров трипанового синего к 10 микролитрам клеточной суспензии в микроцентрифужной пробирке. Затем загрузите 10 микролитров трипановой суспензии голубых клеток на чип одноразового гемоцитометра, чтобы подсчитать клетки.

В биовытяжке с помощью стерильной микропипетки можно передать 50 микролитров клеточной суспензии в центр каждого массива и каждой контрольной чашки Петри. Затем поместите закрытые чашки Петри в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия, на три-четыре часа. Далее аккуратно добавьте по одному миллилитру подогретого DMEM 5/5 в каждую MEA.

Осторожно добавляйте среду по одной капле вокруг внутренних краев MEA и избегайте смывания ячеек от центра массива. После этого наденьте колпачок, содержащий газопроницаемую мембрану FEP, на каждый MEA, прежде чем вернуть их в инкубатор. Через два дня выполните полную замену среды на подогретую DMEM+, вытащив среду из посуды.

Осторожно поместите кончик пипетки на внутреннюю стенку и выдайте один миллилитр подогретого DMEM+Для последующих кормлений вытяните 500 микролитров среды из чашки и выдайте 500 микролитров подогретого DMEM+снова. В этой процедуре осматривайте образцы чашки через день под микроскопом, чтобы найти покрытие клеток по всему массиву и загрязнение бактериями или грибками. Перед тем, как вынуть культуры из инкубатора, подключите регулятор температуры и включите систему, позволив нагретой опорной пластине предусилителя достичь 35 градусов Цельсия.

Затем поместите закрытую культуру в предусилитель так, чтобы черная линия в лунке MEA совпала с эталонной землей. Убедитесь, что контакты предусилителя выровнены так, чтобы верхняя часть предусилителя была надежно закреплена, а конденсаторный колпачок все еще был на месте. Затем нажмите кнопку «Пуск» в программной среде, чтобы начать визуализацию сигналов.

В главном окне выберите Пики, Обнаружение, Автоматически, измените значение стандартного отклонения на минус пять и нажмите Обновить, чтобы сбросить порог. После визуализации сигналов нажмите кнопку «Стоп», «Запись» и «Воспроизведение», чтобы начать запись активности. Эмбриональные нейроны мыши расположены на 60 канальных MEA, что позволяет одновременно регистрировать нейронную активность по сети с каждого электрода.

Ниже приведен репрезентативный растровый график активности восьми электродов в ответ на стимуляцию до и после тренировки. Вертикальная красная линия указывает на время срабатывания стимула, а черные галочки указывают на потенциалы действия. При предварительной тренировке происходит немедленная реакция на импульс стимула по всем каналам.

После тренировки сеть демонстрирует более длительную реакцию активности, а также немедленную реакцию на стимуляцию. Здесь показано среднее значение для 12 обученных и 10 управляющих сетей, обученные сети указывают на значительно измененные частоты спайков. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как изолировать и ассоциировать нейронную ткань эмбриональных мышей, а также быть в состоянии культивировать, записывать и стимулировать нейронные сети из микроэлектродных матриц.