Зависящее от времени увеличение ответа сети на стимуляцию нейронных клеточных культур на микроэлектродных массивах

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и объединении нейронной ткани мыши на стадии E17 для культивирования, регистрации и стимуляции нейронных сетей на микроэлектродных матрицах. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы при изучении динамики сетей в контексте основных механизмов обучения и памяти. Главным преимуществом данной методики является то, что микроэлектродные матрицы способны осуществлять запись с нескольких участков одновременно и, следовательно, обеспечивают лучшее пространственное и временное разрешение по сравнению с традиционной записью с одного участка с помощью стеклянной пипетки.

Хотя этот метод позволяет получить представление о сетевой динамике обучения и памяти, он также может быть использован для исследования токсичности препаратов или разработки парадигм персонализированной медицины следующего поколения. Визуальная демонстрация этого процесса имеет решающее значение, так как манипуляции с тканью в ходе диссекции и диссоциации трудно освоить, просто читая протоколы. Для подготовки матрицы с помощью стерильных наконечников досперов добавьте от 40 до 50 µL размороженного ламининина в центр каждого MEA и 0,2 mL ламининина в контрольные планшеты.

Закройте все MEA и контрольные чашки в биобоксе и перенесите их в инкубатор при 37 °C на один час. Через час осторожно удалите излишки ламинина из центра MEA с помощью аспирации стерильными пипетками Пастера и дайте поверхности высохнуть на воздухе перед высевом. Затем налейте среду L-15 в четыре чашки Петри диаметром 100 мм, закройте их и поместите в морозильную камеру при -20 °C примерно на 40–60 минут, пока среда не приобретет кашицеобразную консистенцию, но не замерзнет полностью.

Для подготовки к диссекции поместите стеклянную чашку Петри отверстием вниз в лоток со льдом. Затем распылите 70% ethanol на нижнюю часть живота животного. С помощью маленьких хирургических ножниц сделайте V-образный разрез кожи и подкожного жира в нижней части живота, продлив разрез до дистальных концов грудной полости, чтобы обнажить матку.

С помощью пинцета осторожно приподнимите матку между эмбрионами. Удалите соединительную ткань с помощью диссекционных ножниц до полного освобождения всей матки. Затем коротко промойте матку 70% ethanol для удаления крови и поместите ее в одну из четырех чашек Петри, заполненных холодным L-15.

Затем, используя два пинцета с тонкими кончиками, извлеките каждый эмбрион из матки и внутренней эмбриональной сумки. Поместите освобожденные эмбрионы во вторую чашку с холодным L-15, после чего перенесите головы в третью чашку Петри, а туловища — в четвертую. В боксе с ламинарным потоком воздуха поместите кусочек автоклавированной фильтровальной бумаги на охлажденный стеклянный предметный столик (чашку Петри) и положите на фильтровальную бумагу голову одного эмбриона.

Затем поместите режущую кромку нижнего лезвия ирисных ножниц в основание черепа; прижимая нижнее лезвие к внутренней поверхности черепа и удерживая его в стороне от мозга, прорежьте затылочную пластинку, а затем проведите разрез по срединной линии между теменными пластинками. Продолжайте разрезать в ростральном направлении между хрящевыми пластинками лобной кости. После этого, начиная от центра затылочной пластинки, сделайте перпендикулярные разрезы влево и вправо от центрального разреза.

После этого осторожно введите небольшой шпатель между вентральной поверхностью мозга и нижними пластинками черепа, пока он полностью не окажется под мозгом. Затем поднимите шпатель, чтобы извлечь мозг. С помощью чистого шпателя сначала удалите обонятельную луковицу, затем диссецируйте лобную долю по трапециевидному шаблону.

Затем перенесите ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую среду для хранения. В данной процедуре используйте два стерильных лезвия скальпеля, чтобы измельчить ткань. Затем добавьте 2,5 мл смеси Dnase и папаина к измельченной ткани в чашке Петри.

Осторожно встряхните чашку Петри круговыми движениями, чтобы все ткани находились свободно в растворе и не прилипали ко дну чашки. После этого поместите чашку в инкубатор при 37 °C на 15 минут. В стерильном боксе с помощью стерильной широкогорелой переносной пипетки перенесите всю среду и ткани в стерильную криопробирку объемом 5 мл.

Поместите кончик той же переносящей пипетки близко к дну пробирки и осторожно проведите читерирование смеси 10–15 раз. Затем добавьте два миллилитра подогретого DMEM 5/5 к смеси диссоциированных клеток и закройте центрифужную пробирку крышкой. Осторожно перемешайте содержимое путем инверсии и центрифугируйте при 573 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.

В стерильном боксе удалите всю супернатант, стараясь не потревожить осадок. Затем добавьте в пробирку к осадку 1 mL подогретой среды DMEM 5/5 для ресуспендирования клеток. Используя стерильную трансфер-пипетку с узким отверстием, аккуратно перемешивайте содержимое путем осторожного пипетирования вверх-вниз до достижения гомогенности смеси.

Затем перенесите 10 µL клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Вне стерильного бокса добавьте 10 µL трипанового синего к 10 µL клеточной суспензии в микроцентрифужной пробирке. Затем нанесите 10 µL суспензии клеток с трипановым синим на одноразовый чип-гемоцитометр для подсчета клеток.

В стерильном боксе с помощью стерильного микропипетора перенесите по 50 µL клеточной суспензии в центр каждого массива и в каждую контрольную чашку Петри. Затем поместите закрытые чашки Петри в инкубатор, нагретый до 37 °C, на три-четыре часа. После этого осторожно добавьте по 1 mL подогретого DMEM 5/5 в каждый MEA.

Осторожно добавляйте среду по одной капле по внутренним краям MEA, стараясь не смыть клетки из центра массива. После этого на каждый MEA установите колпачок с газопроницаемой мембраной из FEP, прежде чем вернуть их в инкубатор. Через два дня проведите полную замену среды на подогретый DMEM+, удалив старую среду из чашки.

Осторожно приложите кончик пипетки к внутренней стенке и внесите 1 mL подогретого DMEM+. Для последующих подкормок извлеките из чашки 500 µL среды и снова добавьте 500 µL подогретого DMEM+. В ходе данной процедуры каждые два дня осматривайте образцы в чашках под микроскопом, чтобы проверить степень покрытия массива клетками, а также отсутствие бактериального или грибкового загрязнения. Перед тем как извлечь культуры из инкубатора, подключите контроллер температуры и включите систему, чтобы подогреваемая нижняя пластина предусилителя достигла 35 °C.

Затем поместите закрытую культуру в предусилитель так, чтобы черная линия в лунке MEA совпадала с опорным заземлением. Убедитесь, что контакты предусилителя совмещены так, чтобы верхняя часть предусилителя была зафиксирована, а колпачок культуры оставался на месте. Затем нажмите «start» в программной среде, чтобы начать визуализацию сигналов.

В главном окне выберите Spikes, Detection, Automatic, измените значение стандартного отклонения на минус пять и нажмите Refresh, чтобы сбросить порог. После визуализации сигналов нажмите Stop, Record и Play, чтобы начать запись активности. Нейроны эмбрионов мыши высевают на MEA с 60 каналами, что позволяет одновременно регистрировать активность нейронной сети с каждого электрода.

Здесь представлен репрезентативный растровый график активности восьми электродов в ответ на стимуляцию до и после обучения. Вертикальная красная линия обозначает время подачи стимула, а черные метки указывают на потенциалы действия. До начала обучения наблюдается мгновенный ответ на стимулирующий импульс во всех каналах.

После обучения сеть демонстрирует более продолжительный ответ активности, в дополнение к немедленному ответу на стимуляцию. Здесь представлено среднее значение для 12 обученных и 10 контрольных сетей; в обученных сетях наблюдаются значительно измененные частоты спайков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и объединять нейронную ткань эмбрионов мышей, а также научиться культивировать, регистрировать и стимулировать нейронные сети с использованием мультиэлектродных матриц.