Количественное определение пигментации брюшной полости в Drosophila melanogaster

Общая цель этой методологии заключается в быстрой количественной оценке пигментации брюшной полости у плодовой мушки Drosophila melanogaster. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эволюционной биологии, такие как идентификация генетических локусов, которые, в свою очередь, лежат в основе морфологии изменчивости, специфичной для доверия, и понимание развития и эволюции морфологических фенотипов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет пользователям неразрушающе измерять различные аспекты абдоминальной пигментации, включая распространение и глубину пигментации.

Хотя этот метод может дать представление о пигментации брюшной полости у Drosophila melanogaster, он также может быть применен к другим видам дрозофил и легко адаптирован для измерения пигментации у других насекомых и таксонов животных. Перед визуализацией мух можно хранить в 70% этаноле для поддержания их пигментации. Для визуализации требуется монтажная площадка.

Загрузите в 60-миллиметровую чашку Петри около 10 миллилитров 1,25%-го агара в воду. Под микроскопом с помощью тонких щипцов выкопайте в геле траншею длиной 20 миллиметров, шириной два миллиметра и глубиной один миллиметр. В одной посуде можно сделать несколько траншей.

Затем закладывают мухи в траншею так, чтобы поверхность для анализа располагалась прямо над поверхностью геля. В этом случае интерес представляет дорсальная сторона. Теперь наполните миску 70% этанолом, пока мухи полностью не погрузятся

Это уменьшает отражения от кутикулы, которые могут скрыть пигментный рисунок. Теперь запустите программное обеспечение для обработки изображений и цифровую камеру, подключенную к микроскопу. Для источника света достаточно холодного света от двойного устройства на гусиной шее.

В программном обеспечении для анализа изображений установите тип изображения на 8-битный. Затем в программном обеспечении для захвата изображений переключите настройку «Трансляция», чтобы открыть окно просмотра камеры. Установите тип изображения на Оттенки серого.

Теперь установите источник света на максимальную интенсивность и расположите свет примерно в 120 миллиметрах от сцены. Установите микроскоп на 60-кратное увеличение, чтобы поле зрения было шириной три миллиметра. Затем поместите двухмиллиметровый микрометр в поле зрения и сфокусируйтесь на нем.

Вернувшись к программному обеспечению, отрегулируйте время экспозиции для просмотра микрометра с помощью поля, найденного в окне экспозиции. Затем установите шкалу. Откройте инструмент «Прямая линия» и проведите вдоль микрометра рабочей области длину в два миллиметра.

Затем введите эту длину в опции «Установить масштаб». После этого в окне должен отображаться масштаб в пикселях на микрон. Обратите внимание на масштаб и произведите коррекцию.

Теперь вернитесь к программному обеспечению для захвата изображений и используйте команды Stop и Snap для захвата изображения микрометра предметного столика. Затем вернитесь в программу для анализа изображений и сохраните изображение в виде файла Tiff. Теперь сосредоточьтесь на спинной средней линии мухи.

Средняя линия должна быть расположена прямо вверх для получения наилучших результатов визуализации. Отодвиньте крылья и любые другие выступающие конструкции и отрегулируйте освещение так, чтобы оно наилучшим образом освещало кутикулу. Затем установите экспозицию в программном обеспечении для захвата изображений, используя гистограмму значения пикселя в качестве ориентира, чтобы захватить полный диапазон пикселей изображения без насыщенности, тем самым максимизируя контраст.

Сохраняйте эту экспозицию и освещение на протяжении всего эксперимента. Теперь, прежде чем делать снимок, убедитесь, что в поле зрения находятся интересующие сегменты живота. Затем сделайте снимок и сохраните изображение с идентификационным номером образца в имени файла.

Используйте формат, описанный в письменном протоколе. В этом анализе используется макрос, предоставленный авторами. Все серии изображений для анализа должны содержаться в одной папке с файлами.

Теперь запустите макрос и следуйте инструкциям. Во-первых, определите местоположение хранимых файлов. Затем определите местоположение, где должны храниться данные анализа.

Затем введите количество символов, которые были использованы в именах файлов, чтобы программное обеспечение правильно прочитало ряд изображений. Следующий запрос предназначен для ширины интересующей области. Здесь введите количество пикселей вдоль передне-задней полосы, которое необходимо проанализировать.

Теперь в подсказке сделайте выбор для анализа первого изображения из серии. Другие варианты — проанализировать следующее изображение в серии или выйти из анализа. Инструмент «Линия» будет выбран автоматически.

Используйте его для определения средней линии на изображении, проведя вдоль нее линию в переднем направлении. Затем следуйте подсказкам макросов, чтобы определить задний край Tergite4 с помощью инструмента линии. Инструмент «Линия» позволяет провести линию от заднего края средней линии к правому боковому краю таким образом, чтобы центр линии находился сразу за задним краем пигментной полосы.

Затем определите передний край Tergite4 с помощью инструмента Линия. Проведите линию от переднего края средней линии к правому боковому краю. Середина линии, очерченной белым квадратом, должна находиться на переднем крае слегка пигментированной кутикулы.

На основе этой информации макрос теперь генерирует профиль пигментации. Однако профиль может быть неточным, если щетина или другие дефекты пересекают полосу, по которой измеряется профиль. Чтобы исправить это, выберите предварительный просмотр в реальном времени в окне гистограммы и настройте линию так, чтобы профиль был гладким.

Чтобы полоска для анализа изображений точно улавливала различные аспекты пигментации, крайне важно определить область анализа, которая будет иметь минимальный шум, вызванный неровностями изображения или образца. Теперь перейдите к анализу Tergite3 на том же изображении, а затем перейдите к следующему изображению. Описанная процедура была использована для изучения известного изменения пигментации живота, вызванного температурой выращивания.

Третий и четвертый тергиты были исследованы несколько раз при различном освещении и экспозиции. Были изучены различные аспекты пигментации. В частности, было обнаружено, что полосы пигментации были шире, когда мух выращивали при более низких температурах.

Затем рассчитанные значения сравнивались с общими субъективными измерениями, сделанными на тех же мухах пятью разными наблюдателями. При оценке 45 самок мух среднее наблюдаемое ранжирование ширины четвертой полосы пигментации брюшной полости тесно коррелировало с автоматическим измерением макроса. Та же пигментная полоса также была измерена вручную с помощью программного обеспечения для визуализации.

Эти результаты также сильно коррелировали с измерениями, полученными с помощью макроса. Затем программное обеспечение было протестировано для измерения пигментации у самок мутантов черного дерева, которые, как известно, имеют повышенную пигментацию в третьей и четвертой пигментных полосах. Метод также был использован для измерения пятой и шестой полос брюшной полости у самок дикого типа.

Автоматизированный метод всегда обеспечивал полезные измерения плотности пигмента и размера полосы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как быстро и точно количественно определить пигментацию живота у дрозофилы. Освоение техники по большей части требует глубокого использования щипцов.

После освоения визуализирующая часть этого метода может быть выполнена со скоростью 50 образцов в час. Извлечение измерений пигментации из этих изображений может быть выполнено со скоростью 70 изображений в час.