Персонализированные иглы для микроинъекций в мозге, грызунов

Общая цель данной методологии заключается в оптимизации протокола микроинъекций в мозг с использованием персонализированных многоразовых кварцевых игл, которые не вызывают заметного повреждения тканей и обеспечивают надежную доставку веществ даже в глубокие отделы. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов нейробиологии, таких как изучение патофизиологии нейродегенеративных и психических заболеваний, а также эффектов генной и клеточной терапии с помощью вирусных векторов и клеточных трансплантатов. Основным преимуществом является то, что данные иглы не вызывают обнаруживаемого повреждения тканей, что гарантирует надежную доставку в глубокие области мозга.

Они экономичны, так как подлежат очистке и повторному использованию. Для начала данной процедуры очистите и стерилизуйте кварцевые капилляры, выдержав их в течение пяти минут в дистиллированной воде, затем в течение пяти минут в 99% ethanol и, наконец, в течение пяти минут в диэтиловом эфире.

Затем оставьте капилляры под вытяжным шкафом минимум на один час до полного высыхания. Тем временем с помощью лазерного пуллера изготовьте длинные тонкие иглы. Затем поместите иглы в чашку Петри, предварительно очищенную 70% ethanol.

Накройте чашку пластиковой парафиновой пленкой. Затем разрежьте капилляры с помощью микродиссектора. Плотно зафиксируйте иглу на предметном столике микроскопа и расположите ее кончик в центре экрана компьютера.

На панели меню нажмите на иконку карандаша и с ее помощью отметьте место разреза иглы. В функциональной боковой панели выберите вкладку с кнопкой Start Cut, чтобы лазер произвел разрез в ранее отмеченной точке. При необходимости прорежьте боковые отверстия, поставив соответствующую метку и повторив процедуру резки без перемещения иглы.

После обрезания иглы подсоедините её к вакуумному насосу с помощью пластиковой трубки. Затем включите насос и вручную установите скорость прямого потока на 3 µL/min. После этого аспирируйте 99% ethanol, а затем дистиллированную воду для удаления загрязнений, возникших при обрезании.

После этого снова аспирируйте 99% ethanol, чтобы облегчить высушивание. Затем храните иглы в плотно закрытой чашке Петри до дня операции. Для повторного использования игл по окончании эксперимента очистите их подходящими моющими средствами и 70% ethanol, чтобы удалить введенный раствор и возможные остатки тканей.

При необходимости эти иглы можно даже прокипятить в специальных стеклянных банках с дистиллированной водой. На этом этапе откройте меню настроек, чтобы откалибровать насос в соответствии с соотношением диаметра к объему шприца для микроинъекций. Установите скорость потока на 0.3 µL/min.

Затем наполните шприц объемом 10 миллилитров стерильной водой. Используйте его для заполнения шприца для микроинъекций и комплекта узлов для инъекций ручного насоса для микроинъекций. После этого присоедините иглу к комплекту ручного насоса для микроинъекций.

Отсоедините шприц объемом 10 миллилитров от микрошприца, медленно нажимая на поршень, чтобы на верхнем конце микрошприца осталась капля воды. Затем вставьте поршень в микрошприц. Теперь подключите микрошприц к насосу и установите скорость потока 0.3 микролитров в минуту.

Затем измените скорость потока до 0.1 microliters per minute и приступите к хирургической процедуре. Для проведения операции выбрейте шерсть на голове животного и очистите кожу спиртовой салфеткой. После этого поместите крысу в стереотаксическую раму.

С помощью стерильного скальпеля сделайте продольный разрез по черепу. Действуйте осторожно, чтобы избежать избыточного кровотечения. После этого раскройте кожу с помощью плоского шпателя и зафиксируйте кожные лоскуты хирургическими зажимами, чтобы поддерживать разрез открытым.

Осторожно отделите надкостницу, чтобы обнажить брегму и область черепа, через которую будет вводиться игла. Затем закрепите манипулятор в стереотаксической раме и переместите кончик иглы точно над брегмой, стараясь не повредить его. Зафиксируйте антеропостериорные и медиолатеральные координаты брегмы и переместите иглу в требуемые координаты.

Затем опустите иглу так, чтобы ее кончик почти касался черепа, и отметьте точку сверления, предварительно немного приподняв стереотаксический манипулятор. Просверлите череп в отмеченном месте, стараясь не повредить мозговые оболочки и мозг. Затем вырежьте небольшой кусочек парафиновой пластиковой пленки и поместите его на череп.

С помощью дозатора на 10 µL нанесите каплю раствора на пластиковую парафиновую пленку. Остановите насос, слегка отведите назад толкатель насоса и создайте небольшой пузырек воздуха в капилляре, аккуратно потянув поршень шприца для микроинъекций. Опустите кончик иглы до касания с каплей.

Медленно потяните поршень шприца для микроинъекций, чтобы набрать образец, избегая образования пузырьков воздуха. Установите толкатель насоса в контакт с поршнем и включите насос, установив скорость потока 0.3 µL/мин. Затем дождитесь образования капли, прежде чем переходить к следующему шагу.

После этого снизьте скорость потока до 0.1 µL/min. Сделайте надрез твердой мозговой оболочки иглой со стальным скошенным кончиком и медленно опустите иглу, чтобы ввести ее в ткани головного мозга. По достижении нужного положения продвиньте иглу еще на 0.1 mm, затем остановите насос.

Поднимите стереотаксическую иглу на 0,1 millimeter и снова запустите насос со скоростью 0,3 microliters в минуту. После этого запустите таймер и начните инъекцию. В процессе введения контролируйте перемещение пузырька.

В завершение остановите насос и подождите пять минут, прежде чем медленно извлечь иглу. Когда кварцевая игла будет полностью извлечена, снова включите насос и проверьте, образуется ли капля на кончике иглы. Затем загерметизируйте отверстие в поверхности черепа костным воском.

Снимите гемостатические зажимы и наложите швы на кожу головы. Нанесите антибиотик в виде крема на область вокруг раны и верните животное в домашнюю клетку. На представленных изображениях показаны корональные срезы мозга крысы толщиной 8 мкм на уровне стриатума.

На данном изображении показаны повреждения, вызванные инъекцией 2 µL ACSF с использованием стальной иглы с тупым концом калибра 26G. Напротив, в стриатуме после инъекции кварцевой иглой заметных повреждений обнаружено не было. На остальных изображениях показаны повреждения, вызванные этими двумя типами игл на уровне дорсального гиппокампа.

Однако кварцевая игла не вызвала заметных повреждений. Успешность инъекций обеими иглами была подтверждена распределением трипанового синего. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура занимает два часа.

После выполнения этих процедур можно провести любые необходимые дополнительные манипуляции, например, повторные хирургические операции, чтобы ответить на другие вопросы, в частности, изучить эффект воздействия лекарственных препаратов. Данная методика открыла исследователям в области нейробиологии путь к изучению влияния токсинов и лекарств, а в последнее время — препаратов для генной и клеточной терапии на животных моделях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять микроинъекции в глубокие области мозга без образования заметных повреждений, используя индивидуально изготовленные кварцевые иглы.

Не забывайте, что использование реагентов и/или патогенов при лазерной микродиссекции может быть крайне опасным. При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как правила техники безопасности при работе с лазером и использование средств индивидуальной защиты.