Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации сайтов интеграции ретровирусных векторов в геноме хозяина и количественной оценке относительных частот популяций клональных клеток, каждая из которых имеет один и тот же сайт интеграции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы ретровирусной генной терапии, такие как какая часть вектора генома хозяина интегрировалась, как генетически модифицированная клетка будет повторно заселяться после трансплантации и чем они функционально отличаются. Основное преимущество этого метода заключается в том, что последовательности сайтов ретроинтеграции могут быть проанализированы с более высокой точностью и чувствительностью путем одновременного секвенирования как восходящих, так и нисходящих соединений векторной ДНК хозяина.

Хотя этот метод может дать представление о безопасности векторов и генно-инженерных клеток в исследованиях генной терапии, он также может быть применен к другим фундаментальным биологическим исследованиям для изучения поведения отдельных клеток in vivo. Первым шагом в этой процедуре является определение концентрации ДНК и коэффициента поглощения на 260 и 280 нанометрах анализируемой геномной ДНК. После этого разбавьте один-два микрограмма образца геномной ДНК до конечного объема в 170 микролитров раствора геномной ДНК, используя воду, свободную от нуклеазы.

Приготовьте 200 микролитров ПЦР-реакции, смешав в микроцентрифужной пробирке. 2,5 микролитра каждого из специфичных для ВИЧ-1 биотиновых праймеров, или всего 10 микролитров для четырех лентивирус-специфичных праймеров, 20 микролитров 10-кратного термостабильного ДНК-полимеразного буфера, четыре микролитра 10 миллимолярных dNTP, три микролитра термостабильной ДНК-полимеразы и 163 микролитра геномной ДНК. Разделите раствор поровну на четыре ПЦР-пробирки и проведите один цикл удлинения при следующем условии.

94 градуса Цельсия в течение 5 минут, 56 градусов Цельсия в течение 3 минут, 72 градуса Цельсия в течение 5 минут и 4 градуса Цельсия при хранении. Объедините все четыре ПЦР-реакции в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Следуйте процедуре производителя набора для очистки ПЦР и выведите 50 микролитров элюирующего буфера.

Приготовьтесь к разложению объемом 100 микролитров, добавив в микроцентрифужную пробирку: 50 микролитров ДНК, 10 микролитров 10-кратного буфера А, два микролитра фермента RSAI и 38 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в термоамплификаторе в течение одного часа.

Далее добавьте в реакцию один микролитр фермента CviQI и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение 30 минут. Когда RSAI и CviQI будут завершены, немедленно приступайте к прямому окончанию. Приготовьте смесь объемом 4,5 микролитра, содержащую 2,5 микролитра ДНК-полимеразы I, Large Fragment и 2 микролитра 10 миллимолярных dNTP.

Перенесите 1 микролитр смеси в образец ДНК. Общий объем составит 102 микролитра. Хорошо перемешайте с помощью вортекса и выдерживайте при температуре 25 градусов Цельсия в течение часа.

Сразу же приступайте к связыванию стрептавидиновых шариков после завершения инкубации. Приготовьте шарики стрептавидина путем кратковременного перемешивания раствора гранул и переноса 50 микролитров в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной подставки и промойте фасоль 200 микролитрами связующего раствора.

Снова суспензируйте бусины в 100 микролитрах связующего раствора и поместите трубку подальше от магнитной подставки. Перенесите 100 микролитров образца ДНК в 100 микролитров ресуспендированного раствора и тщательно перемешайте с помощью пипетирования, чтобы избежать вспенивания раствора. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение 3 часов на вращающемся колесе.

Используйте магнитную подставку, чтобы захватить бусины и выбросить надосадочную жидкость. Промойте шарики дважды в 400 микролитрах моющего раствора и дважды в 400 микролитрах 1X буфера Т4 ДНК-лигазы. Ресуспендируйте шарики в 200 микролитрах буфера 1X T4 DNA ligase и поместите его подальше от магнитной подставки.

Линкерное лигирование следует проводить сразу после связывания стрептавидинового шарика. Приготовьте раствор для реакции лигирования объемом 400 микролитров, смешав следующее в двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке. 0,5 микролитра ДНК-линкера, 10 микролитров 10X Т4 ДНК-лигазного буфера, 20 микролитров 5X Т4 ДНК-лигазы, 5 микролитров Т4 ДНК-лигазы, 164,5 микролитров воды, свободной от нуклеазы, и 200 микролитров ресуспендированных гранул.

Поместите реакционную трубку на вращающееся колесо при комнатной температуре на 3 часа. Промойте шарики дважды промывочным раствором и дважды термостабильным буфером ДНК-полимеразы 1X. Суспендируйте шарики в 50 микролитрах термостабильного ДНК-полимеразного ПЦР-буфера 1X и поместите его подальше от магнитной подставки.

Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 200 микролитров ПЦР-реакции, добавив к ресуспензионным шарикам следующее: 10 микролитров одного 1L-праймера, 10 микролитров 1R-праймера, 20 микролитров праймера Link1, 10 микролитров 10X термостабильного буфера ДНК-полимеразы, четыре микролитра 10 миллимолярных dNTP, восемь микролитров термостабильной ДНК-полимеразы и 88 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Разложите реакционную смесь на четыре ПЦР-пробирки и проведите ПЦР со следующим условием.

94 градуса Цельсия в течение 2 минут, 25 циклов по 94 градуса Цельсия в течение 20 секунд, 56 градусов Цельсия в течение 25 секунд и 72 градуса Цельсия в течение двух минут, и окончательное продление при 72 градусах Цельсия в течение 5 минут. Объедините все четыре ПЦР-реакции в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Следуйте процедуре набора для очистки ПЦР и разведите 50 микролитрами элюирующего буфера.

Определите концентрацию ДНК и коэффициент поглощения на 260 и 280 нанометрах с помощью УФ-видимого спектрофотометра. Теперь ДНК можно хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию до тех пор, пока она не будет готова к следующему этапу. Поскольку процедуры для амплификации левого и правого перехода идентичны, за исключением праймеров, используемых в ПЦР, будет продемонстрирована только амплификация левого перехода.

Приготовьте ПЦР-реакцию объемом 50 микролитров, смешав в пробирке для ПЦР следующее. Пять микролитров ДНК, пять микролитров 10 микромолярного 2L-праймера, пять микролитров 10 микромолярного праймера Link2, 5 микролитров 10X термостабильного ДНК-полимеразного буфера, один микролитр 10 миллимолярных dNTP, два микролитра термостабильной ДНК-полимеразы и 27 микролитров безнуклеазной воды. Проводят ПЦР со следующим условием.

94 градуса Цельсия в течение 3 минут, от 8 до 15 циклов по 94 градуса Цельсия в течение 20 секунд, 56 градусов Цельсия в течение 25 секунд и 72 градуса Цельсия в течение двух минут, и окончательное продление при 72 градусах Цельсия в течение 5 минут. Используйте набор для очистки ПЦР для очистки ДНК и выведите 50 микролитров элюирующего буфера. Определите концентрацию ДНК и коэффициент поглощения на 260 и 280 нанометрах.

Последним шагом в создании библиотек последовательностей левого и правого перехода является анализ вариаций длины ПЦР-ампликона путем выполнения капиллярного электрофореза. Этот репрезентативный результат показывает различную длину ампликонов ПЦР в сайтах интеграции лентивирусных векторов как для верхних, так и для нисходящих соединений векторов-хозяев. Маркер размера ДНК находится в полосе М.

После секвенирования PCR Amplicons выполняется анализ последовательности сайта вычислительной интеграции с использованием собственного скрипта программирования. Анализ сайта двунаправленной интеграции позволяет получить ампликоны ПЦР различных размеров как для восходящих, так и для нисходящих векторных соединений хозяина, визуализированных с помощью капиллярного электрофореза. Сравнение процентной интеграции в генах Alu и L1 повторов лентивирусных векторов в гуманизированных мышиных репопуляционных клетках в пределах случайных интеграционных событий, генерируемых silico, показало, что сайты интеграции значительно обогащены генами.

Относительные частоты детектирования векторных интегромов рассчитывали с использованием только подсчетов последовательностей сайтов интеграции, генерирующих ПЦР-ампликоны размером менее 500.о. Примерно 77% векторов могут быть количественно проанализированы с помощью двунаправленного подхода. В стратегии клональной квантификации мы предполагаем, что каждый отдельный клон имеет один и тот же векторный интеглом.

Относительные частоты левого и правого переходов объединяются для представления относительных количеств клональных популяций, или QVI. Эта цветовая схема показывает относительные частоты 44 клонов QVI в гуманизированных клетках мышей, повторно заселяющих их. Основываясь на анализе случайного интегрирования in silico 10 000, ожидается завышение клональных частот в 1,25 раза при использовании ферментов мотива GTAC, а при использовании фермента мотива TCGA ожидается завышение в 2,56 раза.

После освоения этой техники ее можно разделить на части и завершить за два дня, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что этапы ПЦР чрезвычайно чувствительны, и следует принимать меры предосторожности, чтобы избежать любого загрязнения. Этот метод проложил путь к изучению безопасности терапевтических ретровирусных векторов, а также к изучению долгосрочных моделей репопуляции клонов гемопоэтических стволовых клеток после трансплантации макак-резусов.