Расширение и адипогенез Индукция адипоцитов-предшественников из периваскулярной жировой ткани, изолированной магнитоактивированной сортировкой клеток

Общие цели этих протоколов выделения и дифференцировки заключаются в получении клеток-предшественников адипоцитов из периваскулярных жировых тканей и индуцировании их дифференцировки в зрелые адипоциты. Этот метод позволяет анализировать специфические и определенные популяции клеток-предшественников адипоцитов из периваскулярной жировой ткани с минимальным влиянием на их морфологию, жизнеспособность и потенциал к пролиферации и дифференцировке. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет увеличить выделение антигенпрезентирующих клеток на грамм жировой ткани по сравнению с сортировкой клеток, активируемых флуоресценцией.

После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальца ноги сделайте вертикальный разрез по средней линии вдоль грудины до области промежности крысы, для доступа к брюшной полости. Обнажите верхнюю брыжеечную артерию, мелкие брыжеечные сосуды сопротивления и грудную аорту и разорвите все соединения с брыжейкой и аортой. Соберите гонадную жировую ткань и переложите выделенные жировые пакеты в новую емкость с бикарбонатным буфером Krebs-Ringer, или раствором KRBB, дополненным 10 миллимолярными кучами.

Переложите сосуды в чашку Петри, содержащую раствор KRBB, и поместите чашку под препарирующий микроскоп. Удалите периваскулярную жировую ткань из мелких брыжеечных сосудов сопротивления и аорты. В биозащитный капюшон перенесите около 50 миллиграммов ткани в 1,7-миллилитровую пробирку, содержащую 1 миллилитр раствора коллагеназы I типа, и измельчите ткань на кусочки от 1 до 3 миллиметров.

Важно в достаточном количестве измельчить жировую ткань, чтобы коллагеназа полностью проникла в соединительную ткань. Инкубируйте фрагменты при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 1 часа. Затем последовательно фильтруйте переваренный материал через отдельные 100- и 40-микронные клеточные фильтры в 50-миллилитровую пробирку.

Соберите полученный фильтрат центрифугированием, и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр буфера для лизиса эритроцитов. Перенесите клеточную суспензию в новую 1,7-миллилитровую пробирку Microfuge для 5-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. Затем соберите клетки стромально-васкулярной фракции с помощью другого центрифугирования и ресуспендируйте гранулу в базальной среде стромальной васкулярной фракции для подсчета.

Для выделения клеток-предшественников адипоцитов с помощью магнитно-активированной сортировки клеток, соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулу в блокирующем буфере для сортировки магнитных клеток в концентрации от 1 до 10-6-й клетки на миллилитр в течение 20-минутной инкубации при 4 градусах Цельсия. Важно, чтобы все этапы изоляции проводились при температуре 4 градуса Цельсия, а не по льду. Затем инкубируйте клетки с 5 микролитрами конъюгированного FITC-конъюгированного анти-CD34 мыши в течение 30 минут.

Соберите клетки методом центрифугирования. Затем инкубируйте клетки с 4 микролитрами анти-FITC MicroBeads в 96 микролитрах магнитно-активируемого буфера для сортировки клеток в течение 5 минут в темноте. Пока клетки инкубируются, поместите многосортовую колонку в магнитный сепаратор с 5-миллилитровой пробиркой для отходов под колонкой.

Промойте колонку 500 микролитрами магнитно-активируемого буфера для сортировки клеток и выбросьте сточные воды и отработанную пробирку. Затем поместите новую пробирку под колонку и загрузите клетки в верхнюю часть колонки, собирая непомеченные CD34-отрицательные клетки в новую пробирку для сбора. Когда все клетки пройдут через верхнюю часть колонки, промойте колонку 3 раза 500 микролитрами дегазированного буфера для сортировки магнитных клеток, продолжая собирать элюат в сборной пробирке.

После последней промывки переложите колонку в новую сборную трубку и с помощью поршня колонки протолкните 1 миллилитр магнитно-активированного буфера для сортировки клеток через колонку в трубку, чтобы собрать CD34-положительные клетки. Соберите клетки-предшественники адипоцитов методом центрифугирования. Затем инкубируйте CD34-положительную фракцию в 10 микролитрах рецептора альфа, полученного из антитромбоцитарного фактора роста кролика, в течение 30 минут.

В конце инкубации снова центрифугируйте клетки и инкубируйте гранулу в 4 микролитрах антикроличьих микрогранул IgG в 96 микролитрах магнитно-активируемого буфера для сортировки клеток с магнитными гранулами альфа-положительных клеток, полученных из тромбоцитарных рецепторов фактора роста, как только что продемонстрировано. Для культивирования альфа-положительных клеток-предшественников адипоцитарного рецептора CD34-положительного тромбоцитарного фактора роста засейте клетки в отдельные 6-луночные планшеты для культуры тканей в базальной среде и поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. После 3 последовательных пассажей засейте клетки в черные 96-луночные планшеты для культивирования тканей в соотношении 1 умножить 10 на 2 клетки на лунку и оценить их пролиферацию через 8, 24, 48 и 96 часов в соотношении 5 раз по 10 до 4-х клеток на лунку в 24-луночных планшетах для анализа в соответствии со стандартными протоколами пролиферативного анализа.

Чтобы индуцировать адипогенез, когда культура клеток-предшественников адипоцитов достигает слияния, скармливайте клетки базальной средой прогенитора адипоцитов в течение 48 часов, затем обрабатывайте культуры костным морфогенным белком 4 в течение еще 48 часов. На третий день замените среду средой для индукции клеток-предшественников адипоцитов, без IBMX и экзаметазона в течение 14 дней. Степень адипогенеза в культурах может быть оценена в соотношении от 1 до 10 до 4-х клеток на лунку в 48-луночных планшетах для культивирования тканей в соответствии со стандартными протоколами анализа адипогенеза.

Несмотря на то, что оба метода демонстрируют схожее распределение клеточной популяции и жизнеспособность, магнитно-активируемая изоляция клеток позволяет получить большее количество клеток для культивирования по сравнению с флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток. В этом репрезентативном эксперименте пролиферацию in vitro магнитно-активируемых клеток стромальной васкулярной фракции и клеток-предшественников адипоцитов, выделенных из грудной аорты, небольших брыжеечных сосудов сопротивления и гонадной жировой ткани самцов крыс, оценивали через 8, 24, 48 и 96 часов после посева с помощью количественного анализа ДНК. Никаких различий в скорости расширения стромальной васкулярной фракции не наблюдалось ни в один момент времени, за исключением клеток-предшественников адипоцитов из грудной аорты, которые продемонстрировали меньшую пролиферацию на 96 часов по сравнению со стромальными сосудистыми клетками из того же участка.

Стимуляция сливающихся клеток-предшественников адипоцитов костным морфогенным белком 4 в течение 48 часов индуцирует дифференцировку адипоцитов, о чем свидетельствует большее накопление липидов в каплях, что оценивается как с помощью флуоресцентного анализа на захват липидов, так и с помощью окрашивания Oil Red O. После освоения этой техники ее можно выполнить за 8 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании температуры 4 градуса Цельсия во время этапов изоляции.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и дифференцировать клетки-предшественники адипоцитов.