Мониторинг высвобождения кальция ER / SR с помощью целевого Ca ²⁺ Сенсорный CatchER ⁺

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать наши протоколы культивирования и трансфекции клеток HEK293 и C2C12 с помощью CatchER plus и его применение для мониторинга ERSR-рецепторных переходных процессов кальция при измерении NC2KD. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов кальция и визуализации, такие как базальная концентрация кальция и его быстрые изменения в ERSR определенных клеток, а также как применять биосенсор CatchER plus для этих измерений. Основное преимущество этого метода заключается в том, что флуоресцентный отклик отдельных клеток может быть зарегистрирован в режиме реального времени с помощью быстрой кинетики.

Применение этого метода распространяется на диагностику заболеваний, связанных с кальцием ERSR, поскольку CatchER plus может отслеживать аномальные переходные процессы кальция в этих органеллах, которые возникают из-за дисфункциональных кальциевых сигнальных элементов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы клеточной трансфекции и флуоресцентной визуализации трудно освоить, поскольку клеточная культура и микроскопия имеют множество областей для ошибок. Демонстрировать процедуру будет Флоренс Реддиш, постдок из нашей лаборатории.

Чтобы начать этот эксперимент, поместите клетки HEK293 в стерилизованный стеклянный микроскоп в шестисантиметровые чашки и культивируйте в течение одного-двух дней, пока они не соберутся примерно на 70% в день трансфекции. Далее высыпьте из посуды DMEM и добавьте три миллилитра восстановленной сыворотки среды. Затем добавьте в чашку смесь реагентов для трансфекции ДНК и инкубируйте в течение четырех-шести часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Трансфекция клеток HEK293, как правило, проще, чем у других клеточных линий, но клетки менее устойчивы к суровым условиям. Поэтому крайне важно подвергать их воздействию реагентов для трансфекции только в течение четырех-шести часов, чтобы избежать апоптоза. Через четыре-шесть часов промойте клетки пятью-шестью миллилитрами HBSS.

Выбросьте HBSS из посуды и замените его тремя миллилитрами свежего DMEM. Затем инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить экспрессию GECI. Для клеток миобласта C2C12 трипсинизируйте клетки, добавив от одного до двух миллилитров трипсина, чтобы покрыть дно чашки.

Затем поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на две-шесть минут, чтобы позволить трипсину разрыхлить клетки со дна чашки. Как только инкубация будет завершена, удалите трипсин и аспирируйте клетки в восьми миллилитрах DMEM. Тщательно пипетируйте клетки с помощью DMEM, чтобы равномерно диспергировать и повторно суспендировать клетки.

Затем высадите их на стерильные покровные листы в шестисантиметровых чашках для культивирования, а затем добавьте три миллилитра DMEM, чтобы достичь окончательного слияния в 60%. Инкубируйте их в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации промойте клетки пятью-шестью миллилитрами HBSS.

Выбросьте HBSS из посуды и замените его тремя миллилитрами свежего DMEM. Затем инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов, чтобы обеспечить экспрессию GECI. В этой процедуре включите микроскоп и источник света, затем откройте простую программу PCI.

С помощью ватной палочки покройте дно низкопрофильной камеры визуализации ванны с открытым алмазом тонким слоем герметика. Затем достаньте предметное стекло с трансфицированными клетками из инкубатора и осторожно промойте его три раза примерно одним миллилитром буфера Рингера с 10 миллимолярной глюкозой и 1,8 миллимолярным кальцием, предварительно нагретым до 37 градусов Цельсия. Оставьте в чашке примерно один миллилитр буфера Рингера, чтобы предотвратить высыхание клеток, и используйте щипцы, чтобы вытащить предметное стекло из чашки.

Впитайте излишки раствора, прикоснувшись краем предметного стекла к лабораторной салфетке. Затем поместите его на боковую сторону камеры ячейками в сторону смазки. Впоследствии закрепите камеру на креплении сцены с помощью отвертки.

Добавьте около одного миллилитра буфера Рингера в камеру, чтобы предотвратить высыхание клеток, устанавливая его на предметный столик и завершая настройку микроскопа. Переключите объектив микроскопа на объектив 40-кратного погружения в масло. Добавьте одну каплю иммерсионного масла в объектив.

После этого поместите крепление на предметный столик микроскопа. Затем поместите вакуумный наконечник в камеру, чтобы поддерживать уровень раствора и предотвратить его переполнение. Затем поднимите объектив с помощью регулировки курса до тех пор, пока масло на объективе не коснется нижней части предметного стекла.

Используя режим яркого поля, отрегулируйте усиление на 175 и время экспозиции на 0,03 секунды для фокусировки ячеек. После того, как ячейки сфокусированы, переключитесь в режим флуоресценции с использованием возбуждения 488 нанометров и измените время экспозиции на 0,07 секунды. Найдите поле зрения, в котором достаточно здоровых клеток с достаточной флуоресценцией для визуализации.

Затем сделайте снимки в режиме флуоресценции и яркого поля. Обведите область интереса в ячейках или обведите всю ячейку, чтобы записать интенсивность в выбранной области. Теперь начните измерение интенсивности с установленной частотой кадров один раз в пять секунд.

Дайте базовой интенсивности стабилизироваться в течение 20–30 кадров. Затем рассчитайте количество 4-CMC, необходимое из 20 миллимолярного запаса, исходя из конечного объема камеры 450 микролитров, чтобы получить конечную концентрацию 200 микромоляров. Затем осторожно перенесите 60 микролитров буфера Рингера из камеры в микроцентрифужную пробирку.

Разведите рассчитанное количество 4-CMC этим раствором и добавьте обратно в камеру, чтобы вызвать предполагаемую реакцию визуализируемых клеток. Дайте время для связывания препарата с рецептором и последующего снижения сигнала. Затем промойте клетки тремя-шестью миллилитрами буфера Рингера, одновременно добавляя маркер события.

Повторите процедуры для 100 микромолярных АТФ и 15 микромолярных CPA, используя новое предметное стекло трансфицированных клеток для каждого анализа. После завершения измерения завершите сбор данных в окне измерения интенсивности в простой программе PCI. Затем сделайте флуоресцентные и светлые полевые снимки клеток.

Затем откройте файл данных для эксперимента. Повторно обведите ячейки или области интереса, чтобы при необходимости пересчитать значения интенсивности. Чтобы определить клетки миобласта NC2KD и C2C12, повторите процедуру трансфекции и добавьте в камеру один миллилитр буфера Рингера, не содержащего кальция.

Проникните в клетки от 0,002 до 0,005% сапонина и внутриклеточный буфер в течение 15-30 секунд, чтобы очистить клетки от любого CatchER plus, который может находиться в цитозоле. Затем промойте клетки от трех до шести миллилитров буфера KCL, содержащего EGTA и 10 микромолярных иономицина. Дайте интенсивности уменьшиться, пока не будет достигнуто плато.

После этого промойте клетки от трех до шести миллилитров буфера KCL с 10 микромолярным иономицином и дайте стабилизировать интенсивность. После этого добавьте различные растворы кальция, чтобы интенсивность достигла плато между каждым добавлением. Для калибровки датчика для количественного определения базальной концентрации кальция используйте EGTA и 100 миллимолярный буфер кальция для получения минимальной и максимальной интенсивности флуоресценции.

Здесь показаны репрезентативные признаки нормализованной интенсивности, собранные из проникнутых клеток миобласта C2C12, трансфицированных с помощью CatchER plus. Клетки проникали 0,005% сапонина во внутриклеточный буфер в течение 15-30 секунд. Растворы EGTA и кальция готовили в буфере KCL, а N относится к числу визуализируемых клеток.

Эти врезные флуоресцентные изображения являются представителями клеток до и после лечения. 0,2, 0,6, два, пять, 10, 20, 50 и 100 мкмоль кальция добавляли к пермеабилизированным клеткам миобласта C2C12 в присутствии 10 микромолярного иономицина, чтобы получить KD 3,1 плюс-минус 1,4 миллимоляра. На этом рисунке показано репрезентативное измерение интенсивности CatchER в сочетании с трансфицированными клетками при минимальных и максимальных значениях после добавления одного миллимолярного EGTA и 100 миллимолярного кальция с 10 микромолярными иономицинами соответственно.

После освоения этой техники она может быть выполнена за 30-60 минут для визуализации или за три дня, если она включает трансфекцию. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что всегда нужно работать с клетками в стерильной среде, подготовить реагенты перед экспериментом, нанести ровный слой смазки на камеру и приложить вакуум перед началом. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как уровень экспрессии CatchER plus.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области передачи сигналов кальция и визуализации для изучения динамики кальция ERSR в клетках млекопитающих. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансфектировать клетки и визуализировать их с помощью CatchER plus.