Быстрый и эффективный метод для того чтобы рассечь куколки крылья дрозофилы подходит для Immunodetections или анализы ПЦР

Общей целью этой процедуры является быстрый и эффективный метод препарирования крыльев куколки дрозофилы, пригодных для иммунодетектирования или ПЦР-анализов. Описанная здесь процедура была разработана с целью поиска быстрого и эффективного метода получения образцов крыльев куколки, пригодных для проведения ПЦР-анализов или протоколов иммунодетектирования. С помощью влажной кисти аккуратно извлеките куколку APF нулевого часа из флаконов с культурой и поместите ее в новые флаконы, чтобы завершить период развития.

Например, при использовании куколки с APF 24 часа, она останется во флаконе только на 22 часа. Через 22 часа перенесите куколку на предметное стекло микроскопа с приклеенным к ней двусторонним скотчем. Этот перенос можно сделать с помощью кисти, чтобы не повредить куколку.

Куколка должна располагаться в виде ряда спинными сторонами вверх и головными концами, обращенными в одном направлении. После этого верните предметное стекло микроскопа к постоянной температуре и дайте куколке завершить соответствующее время развития. В этом случае это будет 24 часа.

Предметное стекло микроскопа с двусторонним скотчем будет представлять собой временную диссекционную платформу для удаления куколки. В течение двух часов на предметном стекле микроскопа куколка высохнет, что сделает ее легко сломанной щипцами. Первым этапом вскрытия является извлечение куколки из туши.

Затем куколку переложат на другую горку с приклеенным к ней двусторонним скотчем. Туша останется позади. Эта куколка будет приклеена брюшной стороной вверх, помещена в середину ленты.

Перед выполнением разреза крыла куколку необходимо покрыть раствором согласно процедуре с использованием иммуногистохимии. Такое решение будет аффиксативным и крыло освободится от кутикулы. С помощью щипцов аккуратно удалите оперкулум из куколочного корпуса.

Разорвите корпус щипцами, проведя линию вдоль боковой части куколки до каудального ее конца. При соответствующем освещении можно визуализировать внутреннюю форму куколки, создав видимое пространство прямо над шарниром крыла куколки. Это пространство служит ориентиром для выполнения вскрытия, не повреждая куколку.

Поскольку корпус открыт сбоку, можно будет удалить его части, подняв их за открытую границу и перенеся на противоположную сторону, где они будут удерживаться двусторонней лентой. По окончании вскрытия куколка будет практически голой. Только часть чехла будет прикрывать задний кончик.

С помощью щипцов аккуратно надавите на оставшуюся часть корпуса. Это движение поднимет внутренний конец куколки, позволяя голове и грудной клетке оставаться в предпочтительном положении, чтобы прилипнуть к следующему шагу. Возьмите новую горку с двусторонним скотчем и переверните ее на куколке.

Затем слегка надавите, чтобы куколка прилипла к ленте, и аккуратно сдвиньте слайд для того, чтобы вытащить куколку из остальных корпусов. Переверните предметное стекло микроскопа. Куколка будет застрять на спинной стороне на уровне головы или области грудной клетки.

Для использования иммуногистохимии покройте всю голую куколку 4% параформальдегидом. Через 10 минут в аффиксации, с помощью ножниц, сделайте небольшой надрез в области шарнира крыла или возле него. Дайте аффиксативу достичь эпителия крыла.

Затем через пять минут оторвите щипцами от границ кутикулы, расширяя отверстие и давая возможность освободить эпителий крыла из кутикулы. Как только ткань крыла освободится, оставьте ее в растворе параформальдегида до завершения 30-минутной фиксации. Метод препарирования, описанный в этом видео, может быть использован для получения высококачественных образцов крыльев куколки дрозофилы с разных стадий развития для многих видов методов.

Протокол может быть выполнен для вскрытия одной куколки или нескольких куколок одновременно. Это способствует ускорению процедуры, облегчая доступ к большому количеству рассекаемых крыльев. Чтобы извлечь голую куколку из вскрытого корпуса, важно, чтобы задний кончик был достаточно маленьким.

Несмотря на то, что можно удалить ряд из четырех или пяти голых куколок одновременно, это не имеет значения, так как можно удалить оставшиеся, прикрепленные к их футляру, в последовательные шаги с помощью одного двустороннего скотча. Это конфокальное изображение крыла APF в диапазоне от 24 до 30 часов. Окрашивание показывает экспрессию пятнистого белка, канонического рецептора ежа, ядер и актиновых филаментов.

Аналогичный процесс препарирования может быть использован для получения более крупных образцов крыльев для выделения мРНК. Эта мРНК может быть использована для синтеза кДНК, которая может быть использована в реакциях ПЦР. Здесь мы показываем продукты, полученные для определения экспрессии патчированного и актина.

Протокол предлагает простой метод получения образцов крыльев куколки, которые сохраняют знакомую морфологию крыла. С помощью этих препаратов можно получить стеки изображений, которые могут быть спроецированы в виде 2D или 3D изображений для исследования распределения и/или обогащения белков во время дифференцировки крыла. Аналогичный протокол может быть использован для сбора большого образца крыла куколки, необходимого для синтеза кДНК, молекулы, необходимой в реакциях ПЦР.

Эта процедура обеспечивает альтернативный и дополняющий подход к уже опубликованным методам диссекции крыльев куколки.