Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Этот протокол описывает простой метод для изоляции и культивирования мыши мозгового гранул нейронов (КСГН) от 6-7 день старого щенков, эффективное трансдукции КСГН потери и получить функция исследований и моделирования NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность нейронов, Низкий калий индуцированной клеточную гибель, повреждение ДНК и оксидативного стресса, с использованием той же модели культуры.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить здоровые чистые популяции гранулярных нейронов мозжечка, а также генетически манипулировать ими и смоделировать различные механизмы повреждения нейронов в первичной культуре in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области повреждения нейронов. Мы используем этот протокол для исследования основных молекулярных механизмов нейронных повреждений после острого повреждения головного мозга и нейрогенеративных заболеваний.

Основное преимущество этого протокола заключается в том, что мы можем моделировать различные механизмы клеточной смерти, такие как эксайтотоксичность, окислительный стресс, повреждение ДНК и событие развития, используя систему культивирования. Хотя этот метод может дать представление о повреждении нейронов, он также может быть использован с нейронами мозжечка крыс для изучения нейронной активности и морфогенеза в ответ на факторы роста и побочные события. Чтобы извлечь мозг шести-семидневной мыши, используйте пару щипцов, чтобы захватить голову, и с помощью ножниц для микродиссекции разрежьте кожу спереди по направлению к голове.

Отодвиньте кожу, чтобы обнажить череп. Далее проникните в череп кончиком ножниц и разрежьте спереди и сбоку. Соблюдая осторожность, чтобы не повредить мозжечок и облегчить идентификацию и удаление мозговых оболочек, затем используйте щипцы для отслаивания черепа, обнажая мозг.

С помощью щипцов или шпателя аккуратно вытащите мозг в прохладный раствор для вскрытия. Чтобы изолировать мозжечок, поместите мозг в раствор для вскрытия, дополненный сульфатом магния, и держите раствор и мозг на льду. Под диссекционным микроскопом удалите мозговые оболочки с помощью тонких щипцов, затем рассеките мозжечок из головного мозга в диссекционном растворе, дополненном сульфатом магния.

Это помогает отшелушивать оставшиеся мозговые оболочки и позволяет проникать между слоями для очистки складок мозжечка. Наличие мозговых оболочек в культуре нейронов приводит к нездоровым клеткам и возможной их гибели. Таким образом, важно обеспечить полное удаление мозговых оболочек, прежде чем приступать к бактериологическому культивированию.

После этого поверните мозжечок на его вентральную сторону и обеспечьте удаление сосудистого сплетения. Далее вытащите мозжечок в 35-миллиметровую посуду, содержащую один миллилитр сульфата магния, дополненного раствором для вскрытия. Нарежьте ткани на мелкие кусочки и перенесите их в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 30 миллилитров буферного раствора для рассечения сульфата магния.

На этом этапе центрифугируйте 15-миллилитровую пробирку, содержащую измельченную мозговую ткань, в течение пяти минут при температуре 644 раза больше и четырех градусах Цельсия. После этого удалите надосадочную жидкость, и добавьте 10 миллилитров раствора для диссекции трипсина. Затем встряхивайте стол на высокой скорости в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Добавьте два миллилитра раствора ингибитора трипсина, один в тюбик и осторожно покачивайте в течение двух минут. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 644 g и четырех градусах Цельсия. Через пять минут достаньте надосадочную жидкость, и добавьте два миллилитра раствора ингибиторов трипсина за два до того, как переложите его в 15-миллилитровую пробирку.

Затем растирайте ткань в 15-миллилитровой трубке до тех пор, пока раствор не станет мутным. Дайте ему отстояться в течение пяти минут. Затем удалите прозрачную надосадочную жидкость и переложите ее в новую пробирку, содержащую один миллилитр хлорида кальция, дополненный раствором для рассечения.

Добавьте еще два миллилитра раствора ингибитора трипсина два на дно пробирки, содержащей гранулу. Снова разомните и дайте отстояться в течение пяти минут. Извлеките надосадочную жидкость и добавьте ее в пробирку, содержащую надосадочную жидкость, полученную на предыдущем этапе.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть ткани не будет механически диссоциирована. Добавьте 0,3 миллилитра хлорида кальция, дополненного диссекционным раствором, в сбор надосадочной жидкости на каждый миллилитр надосадочной жидкости. Перемешайте содержимое пробирки, а затем центрифугируйте в течение пяти минут при 644 G при комнатной температуре.

После этого удалите надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу 10 миллилитров свежей среды и перемешайте. Затем подсчитайте живые клетки и разведите их до концентрации 1,5 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр.

Поместите клетки на предварительно подготовленные поли D-лизиновые пластины. Для четырех луночных планшетов планшетом наносят 0,5 миллилимитера образца с подачей 7,5 умножить на 10 пятых клеток на лунку. Для 35-миллиметровой посуды налейте на тарелку четыре миллилитра пробы, дав шесть умножить на 10 до шестой клетки на тарелку.

Для покровных листков, пластину 0,5 миллитра, дающую 7,5 умножить на 10 до пятой клетки на лунку. Через 24 часа добавьте AraC в пластины, чтобы уменьшить глиальное загрязнение. Если клетки должны сохраняться в течение семи-восьми дней, повторите эту обработку на третий день и поддерживайте культуры в инкубаторе с 5%-ным содержанием CO2 при температуре 37 градусов Цельсия.

Для культур, которые поддерживаются дольше пяти дней, вводите в культуру глюкозу каждые два дня, начиная с пятого дня. Чтобы вызвать нейрональную эксайтотоксичность с помощью NMDA, после семи дней in vitro обрабатывайте гранулярные нейроны мозжечка 100 микромолярными NMDA и 10 микромолярными глицинами в течение одного часа. Затем замените среду кондиционированной средой из параллельных культур без обработки.

Эта концентрация приводит к 50% гибели клеток через 24 часа после лечения. Для индуцированной гибелью клеток АФК обрабатывайте нейроны перекисью водорода при давлении от 75 до 100 микромолей в течение пяти минут. Через пять минут переключите его на кондиционированные носители из параллельных языков и региональных параметров.

Из-за нестабильности перекиси водорода концентрация должна быть оптимизирована до уровня, который вызывает от 50 до 70% гибели клеток через 24 часа. Эта концентрация обычно составляет от 75 до 100 микромоляров. Чтобы вызвать гибель клеток в результате повреждения ДНК, обработайте гранулярные нейроны мозжечка 10 микромолярными камптотекинами, чтобы вызвать гибель более 50% клеток в течение 24 часов.

При низком калий-индуцированном апоптозе нейронов в гранулярных нейронах мозжечка измените среду, содержащую 25 миллимоляров калия, на среду с низким содержанием калия с пятью миллимолярами калия после семи дней in vitro. Нейроны трансдуцировали лентивирусом для RFP на MOI из трех на момент осаждения. Фиксация и окрашивание в течение семи дней in vitro.

Показано, что ко-локализация RFP-сигнала MAP2 и Hoechst демонстрирует здоровые нейроны, которые полностью трансдуцируются лентивирусами. На изображениях, показанных здесь, представлены анализы нейронов, инфицированных различными MOI аденовируса, для измерения токсичности. Гранулярные нейроны мозжечка, инфицированные аденовирусом, экспрессирующим LacZ при MOI от 25 до 50, обеспечивают максимальную эффективность при сохранении минимальной токсичности.

Разница в выживаемости клеток по сравнению с контролем наблюдается менее чем на 1% при инфицировании при этом MOI. Эти рисунки показывают окрашивание по методу Хёхста контрольных гранулярных нейронов мозжечка и гранулярных нейронов мозжечка, обработанных NMDA, чтобы вызвать гибель клеток. Обратите внимание на образование пикнотических ядер при NMDA-обработке.

Это является признаком гибели клеток и может наблюдаться примерно у 50% культуры через 24 часа после обработки 100 микромолярными NMDA и 10 микромолярными глицинами. После освоения этой техники ее можно выполнить за два с половиной часа с шестью щелчками мыши, если она выполнена правильно. При выполнении этой техники важно использовать асептическую технику и цепные хирургические инструменты, чтобы свести к минимуму риск заражения культуры.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейронауки к изучению развития нейронов и повреждения нейронов в первичных нейронах мыши. После просмотра этого видео вы сможете культивировать зернистые нейроны мозжечка, генетически манипулировать ими с помощью вирусов и вызывать различные механизмы повреждения нервной системы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунофлуоресценция или анализ жизнеспособности клеток, чтобы ответить на такие вопросы, как увеличивает ли интересующий ген выживаемость клеток в ответ на эксайтотоксичность, окислительный стресс или повреждение ДНК.