Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

Целью этой процедуры является выделение и идентификация клональных нокаутных клеточных линий, полученных в результате двух типов CRIPSR/Cas9-опосредованного редактирования генома. Один метод обнаруживает нокаут белка, вызванный негомологичном соединением концов, в то время как другой обнаруживает геномные возмущения, вызванные репарацией, направленной на гомологию. Этот метод особенно полезен в области молекулярной биологии, где генерация клеточных линий с генетическими возмущениями является важным инструментом в анализе функции генов.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что это быстрый и относительно высокопроизводительный метод, который может быть легко реализован с использованием базовых методов молекулярной биологии. Негомологичное соединение концов приводит к небольшим делециям или вставкам и оценивается с помощью точечного иммуноблота, в то время как гомологически направленная репарация позволяет проводить более крупные и точные возмущения и оценивается с помощью ПЦР колоний. В этом эксперименте используются клетки T-REx-293, культивируемые в среде DMEM, с добавлением 10% FBS при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Перед трансвекцией поместите клетки на шесть луночных планшетов и включите лунку для нетрансвектированного контроля. Нарастите клетки примерно до 70% конфлюенции. Трансвектируйте клетки с 2,5 микрограммами общей плазмиды с использованием коммерческого протокола трансвекции.

Для трансвекции клеток без отбора используют 2,5 мкг плазмиды Cas9-sgRNA. Для трансвекции клеток с селекцией используют 0,75 мкг Cas9-sgRNA1, 0,75 мкг Cas9-sgRNA2 и 1 мкг гомологичного рекомбинационного шаблона. Инкубируйте трансвектированные клетки и нетрансвектированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 48 часов.

Для клеток, трансвекцированных с помощью отбора, начните подбор препарата с обработки клеток соответствующим препаратом, которым в данном случае является Неомицин. Верните шестилуночный планшет в инкубатор. Наблюдайте за обработанными клетками один раз в день, чтобы проверить скорость гибели клеток, пока все клетки в нетрансвекцированном контроле не умрут.

Чтобы изолировать клональные популяции, сначала вырастите клетки до 100%-ного слияния в исходном слое после отбора. Далее производят серийные разведения клеток и подсчитывают клетки. Поскольку правильное создание моноклональных колоний является ключом к получению полного нокаута, необходимо позаботиться о том, чтобы определить правильное разведение для посадки клеток с желаемой плотностью.

После того, как будет определено правильное разведение, поместите элементы в 96-луночные планшеты с плотностью 0,33 ячейки на лунку. Установка трех 96=луночных пластин является хорошей отправной точкой для обеспечения изоляции более чем одного правильного клона. В течение двух-четырех недель наблюдайте за колониями до тех пор, пока они не станут видны глазу.

На этих репрезентативных изображениях показаны колонии на разных стадиях роста. Одна клетка при сидении, ячейки на пятый день и хорошо укоренившаяся колония на 10-й день. С помощью стерильного наконечника для пипетки тщательно и точно выберите видимые колонии и пересадите их в новые лунки, чтобы стимулировать рост монослоя.

Продолжайте выращивать клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Кандидаты в нокаут без отбора проходят скрининг с помощью точечного иммуноблоттинга для оценки белкового продукта с высокой пропускной способностью. После выращивания отдельных клонов до 50-100% конфлюенции вытесните монослой клеток путем пипетирования в лунке.

Аликвотировать 90 микролитров из общего объема 100 микролитров из каждой лунки в чистую микроцентрифужную пробирку. Для целей этого видео будут обработаны только два образца. Уменьшите скорость вращения до 6 000 об/мин в течение пяти минут, извлеките среду и лизируйте поддон ячейки в 10 микролитрах загрузочного буфера 1X SDS.

Добавьте 90 микролитров новой среды к оставшимся клеткам в лунке и верните планшет в инкубатор, чтобы продолжить размножение клеток. Нанесите пипеткой один микролитр клеточного лизата на сухую нитроцеллюлозную мембрану, чтобы образовалась точка. Промокните каждый образец дважды на двух отдельных мембранах, создавая два идентичных рисунка образцов.

Заблокируйте мембраны в 5% молоке в TBST при комнатной температуре, с покачиванием, на один час. Через час промокните мембраны первичными антителами при рекомендуемом первичном разведении антител и TBST плюс 5% молока. На одной мембране используют первичное антитело против целевого белка ELAVL1 в этом эксперименте.

На другой мембране используйте первичное антитело для контрольного белка, который, как ожидается, не изменится, здесь используется PUM2. Выдерживать при комнатной температуре в течение одного часа. Удалите первичный раствор антител из каждой блотки, добавьте TBST и инкубируйте в течение пяти минут.

Таким образом, промойте кляксы три раза TBST. Далее добавьте на каждую мембрану соответствующее HRP-конъюгированное вторичное антитело, и промокните при комнатной температуре в течение одного часа. Через час промойте мембраны трижды с TBST в течение пяти минут каждый раз.

Нанесите на блотки раствор хемилюминесцентной подложки, следуя инструкциям производителя, и нанесите изображение промокающих мембран на цифровой хемилюминесцентный тепловизор. Наконец, количественно оцените интенсивность точек для целевых и контрольных белков с помощью соответствующего программного обеспечения и проанализируйте результаты, как описано в текстовом протоколе. Кандидаты с селективным маркером резистентности проходят скрининг с помощью ПЦР колоний.

Начните эту процедуру с дублирования отдельных колоний в новом 96-луночном планшете и выращивания их до 100% конфлюенции для получения клеточных лизатов. Удалите среду из одного набора клонов, повторно суспендируйте клетки из каждой лунки в 30 микролитрах экстракционного буфера из коммерческого набора для подготовки ДНК и переложите в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Нагрейте раствор до 96 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем дайте остыть до комнатной температуры.

Добавьте по 30 микролитров стабилизационного буфера в каждую микроцентрифужную пробирку и хорошо перемешайте. Чтобы идентифицировать дикий тип и моноаллельные или биаллельные мутантные линии с помощью колонийной ПЦР, разработайте два отдельных набора праймеров для ПЦР для амплификации областей вокруг групп гомологии на основе успешной или неудачной интеграции резистентной кассеты. С каждой стороны используйте общий праймер, который отжигает за пределами плеча гомологии.

Для проверки аллеля дикого типа используйте общий праймер с соответствующим парным праймером, который комплементарен эндогенной последовательности, охватывающей область гомологии. Чтобы проверить желаемую мутацию, используйте общий праймер с другим парным праймером, дополняющим вставленную кассету сопротивления. Для каждого испытуемого образца готовят реакционную смесь, содержащую 0,5 микролитра клеточного лизата, 1,25 микролитра 10-кратного буфера КОД, 0,75 микролитра 25 миллимолярного сульфата магния, 1,25 микролитра двух миллимолярных дНТФ, 0,375 микролитра прямого праймера, 0,375 микролитра обратного праймера, 0,25 микролитра полимеразы КОД и 7,75 микролитра воды.

Проведите ПЦР при следующих условиях: 95 градусов Цельсия в течение двух минут, затем 25 циклов 95 градусов Цельсия в течение 20 секунд, температура плавления праймера в течение 10 секунд и 70 градусов Цельсия в течение 20 секунд на KB. Затем визуализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Редактирование генома с использованием негомологичного соединения концов проводили для генерации нокаутных линий ELAVL1 с последующим точечным иммуноблоттингом, зондированием ELAVL1 и PUM2. Клоны, которые показывали слабый управляющий сигнал, были помечены крестиком и исключены из дальнейшего анализа.

Клоны с низким уровнем сигналов ELAVL1 были дополнительно протестированы методом вестерн-блоттинга. Подтвержденные кандидаты обозначены зеленым цветом, а недействительные — серым. На этом графике показаны отношения ELAVL1 к контролю сигнала белка в порядке возрастания.

В большинстве случаев клональные популяции с самым низким относительным сигналом ELAVL1 были правильно идентифицированы как нокауты. Кандидаты, полученные методом направленной репарации гомологии, были проверены с помощью ПЦР колоний, а продукты ПЦР визуализировались с помощью электрофореза в агарозном геле. Приведены примеры результатов с использованием праймеров, охватывающих входящее интеграционное соединение, с использованием эндогенных внутренних праймеров и выбивных внутренних праймеров.

Праймеры сначала были проверены как в родительских клетках, так и в объемных отобранных клетках. Показаны результаты по 24 отдельным клонам-кандидатам вместе с ожидаемыми полосами для клонов дикого типа, нокаута и моноаллельной делеции. Черными стрелками обозначены правильные продукты усиления, звездочками обозначены биаллельные нокаутные клоны.

Биаллельные мутантные линии были дополнительно подтверждены с помощью вестерн-блоттинга. Негомологичное соединение концов использует один разрез Cas9 и независимое от выбора скринингование, что не требует предварительной подготовки, а скрининг на нокаутные клоны с помощью точечных блоттингов может быстро определить, было ли создание нокаута успешным. Скрининг на основе ПЦР точно выявляет правильных кандидатов с большими геномными возмущениями, вызванными репарацией, направленной на гомологию.

Эти методы позволяют исследователям в области молекулярной биологии легко и эффективно идентифицировать нокауты, что позволяет им исследовать нормальные или дисфункциональные клеточные процессы с использованием клеточных линий. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и идентифицировать клональные нокаутные клеточные линии, полученные с помощью редактирования генома, опосредованного CRISPR/Cas9.