Расследование фон Виллебранда фактор патофизиологии с помощью потока камеры модели фон Виллебранда фактор тромбоцитов строки формирования

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы наблюдать и количественно оценить фактор фон Виллебранда или образование тромбоцитарной струны VWF в ответ на секретагоги. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии фактора фон Виллебранда и ваво-паллиативной патофизиологии тела. Это также помогает нам ответить на вопросы о мутациях, которые нарушают высвобождение фактора фон Виллебранда и функцию связывания тромбоцитов.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она воспроизводит in vivo взаимодействия между субэндотелиальным коллагеном, эндоэтолиальными клетками VWF и тромбоцитами в визуальной и количественно измеряемой системе in vitro. Я считаю, что визуальная демонстрация этого метода жизненно важна. Необходимые этапы микроскопии для захвата образования струны VWF-тромбоцитов в нескольких одновременных условиях в режиме реального времени может быть трудно освоить только с помощью текста.

Начните с загрузки 0,5 миллилитров буфера для коллагенового покрытия в шприц с люэровским замком объемом 1 миллилитров. Поверните конец шприца на резервуар ползуна проточной камеры и медленно нажимайте на поршень, пока вся дорожка не будет покрыта и каждый резервуар не заполнится. Долейте резервуары, чтобы убедиться, что каждый из них полон.

Когда все дорожки будут загружены, инкубируйте камеру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день с помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите буфер с коллагеновым покрытием. Затем промойте каждую дорожку с помощью HBSS, отсасывая физиологический раствор с помощью пипетки объемом 200 микролитров.

После того, как третий раунд HBSS будет отброшен, добавьте примерно три раза по 10 к 6-му эндотелиальным клеткам кровного роста на миллилитр в 100 микролитрах питательной среды, добавив 10% FBS на каждую дорожку проточной камеры. Затем верните камеру в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 24 часа, меняя среду каждые восемь-12 часов. Чтобы собрать проточный аппарат, сначала прикрепите по одному наружному соединителю Люэра к одному концу каждого из трех 70-сантиметровых кусков стерильной силиконовой трубки.

И прикрепите по одному адаптеру с внутренней резьбой люэра к другому концу каждой трубки. Подключите адаптеры с внутренним люэровским замком к отдельным шприцам объемом 20 миллилитров и запрограммируйте шприцевую помпу. Загрузите шприцы на насос и плотно закрепите скобы вокруг шприцев и вантузов.

Затем прикрепите отдельные наружные луэры локтя к обоим концам трех разных 20-сантиметровых кусков стерильной силиконовой трубки и подсоедините затупленную иглу 18 калибра к одному из трех луэров локтя. Затем на вращающемся дисковом микроскопе, оснащенном полностью автоматизированным столиком, выберите объектив 20x и установите соответствующие настройки канала. Чтобы получить полный динамический диапазон данных, установите устройство, умножающее заряд электронов, на коэффициент умножения электронов равный 150 с временем экспозиции 200 миллисекунд.

Отрегулируйте мощность лазера 491 нанометр до 20% и с помощью программного обеспечения микроскопа отметьте центр всех трех полос. Установите диапазон Z на 1,0 микрометра и размер шага на 0,5 микрометра. Наконец, выберите продолжительность и интервал для съемки изображения каждые 10 секунд с 60 временными точками на слайде.

Для индуцирования образования VWF-тромбоцитарных гирлянд заменяют питательную среду с трех дорожек проточной камеры, используя только бессывороточную среду в качестве контроля, затем интересующий стимулятор разводят в 100 микролитрах бессывороточной среды на дополнительные дорожки. Затем выдержать камеру в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце периода стимуляции промойте все три дорожки 100-200 микролитрами PBS и используйте сосудистые зажимы, чтобы нанести проточную камеру на подставку для слайдов.

Прикрепите по одному люэровскому соединителю с конца куска трубки длиной 70 см к каждому резервуару проточной камеры. И запустите шприцевой насос, чтобы удалить PBS для смывателя. Внесите дополнительный PBS в резервуар проточной камеры, расположенный напротив, чтобы дорожки не пересыхали.

Как только эквивалентный расход подтвердится, приостановите работу шприцевого насоса. Присоедините шприц диаметром 5 миллилитров с муфтой люэра с внутренней резьбой к первому свободному разъему люэра с наружной резьбой. И погрузите затупленную иглу в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, содержащую флуоресцентно меченный промытый раствор тромбоцитов.

Медленно втяните тромбоцитарный раствор через трубку, чтобы убедиться, что в системе нет пузырьков воздуха. Присоедините наружный луэр к открытому резервуару проточной камеры и загрузите две другие дорожки раствором тромбоцитов, как показано выше. Проверьте настройку системы расхода, чтобы убедиться в надежности всех соединений.

Перезапустите шприцевой насос и визуализируйте поток тромбоцитов в течение 10 минут в темноте. Затем отсоедините люэр от впускной трубки на резервуаре проточной камеры. И заполните резервуар PBS для поддержания мягкого потока физиологического раствора над монослоем эндотелиальных клеток.

Чтобы количественно оценить образование струны VWF и тромбоцитов, сделайте 10 изображений на слайде с каждой полосы без перекрытия от середины слайда. Когда все изображения будут получены, откройте программу обработки изображений и нажмите «Изображение», «Отрегулируйте» и «Контраст яркости». Чтобы настроить яркость первого изображения, перетаскивайте полосу прокрутки до тех пор, пока прилипшие тромбоциты не станут достаточно хорошо видны для количественной оценки.

Затем запишите строку VWF-тромбоцитов, когда наблюдаются три или более выровненных тромбоцитов, и подсчитайте все строки на изображении. После инициации условий потока необработанные клетки демонстрируют очень мало VWF-тромбоцитарных нитей по сравнению с клетками, обработанными гистамином или PMA. Которые демонстрируют в среднем две-три строки на поле зрения.

Кроме того, гистоны, которые активируют тромбоциты, а также эндотелиальные клетки, индуцируют выработку большего количества VWF-тромбоцитарных цепей, чем необработанные, гистаминовые или PMA-стимулированные контрольные группы. Во время этой процедуры держите тромбоциты в неподвижном состоянии до начала эксперимента с потоком, выбрасывая первую пробирку для забора крови, поддерживая все реагенты при комнатной температуре и используя щадящую технику пипетки. В эту процедуру могут быть внесены изменения для оценки формирования нитей VWF-тромбоцитов в присутствии лейкоцитов, активирующих тромбоциты агентов или растворения нити расщепляющим атомом фермента TS13.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить образование VWF-тромбоцитарных струн в секретогоге и модель проточной камеры in vitro.