Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Общая цель данной процедуры заключается в картировании сайтов интеграции ретровирусных векторов на основе мышиного лейкозного вируса для определения клеточно-специфических регуляторных областей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в исследованиях генной терапии и регуляции генов, такие как определение мест интеграции вектора в геноме человека и того, какие регуляторные элементы могут активно использоваться конкретным подтипом клеток. Идея данного метода возникла после наблюдения за тем, что в исследованиях генной терапии векторы MLV интегрируются в активные специфические промоторы и энхансеры.

Начните с трансдукции целевых клеток ретровирусным вектором на основе MLV, содержащим репортерный ген EGFP и псевдотипированным гликопротеином оболочки VSV-G или амфотропным гликопротеином. В качестве отрицательного контроля используются клетки, подвергнутые ложной трансдукции. Через 48 часов после трансдукции центрифугируйте образцы, затем ресуспендируйте 100 000 клеток в 300 µL PBS, содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки.

Затем измерьте экспрессию EGFP с помощью проточной цитометрии. Соберите еще от 0,5 до 5 миллионов трансдуцированных клеток для выделения геномной ДНК и последующего расщепления рестриктазами. Подготовьте четыре пробы с расщеплением рестриктазами для каждого образца в пробирках объемом 1,5 мл.

Проведите переваривание от 0,1 до одного микрограмма G-DNA в каждой пробирке. Добавьте 10 units TRU91 и один микролит буфера M на образец до конечного объема 10 микролитров. Внесите два микролитра смеси в пробирки для переваривания.

Затем инкубируйте реакционные смеси при 65 °C в течение шести часов или в течение ночи. После инкубации добавьте 40 µL воды в пробирку объемом 1,5 mL. В ту же пробирку добавьте 10 единиц PST1 и 1 µL буфера H на каждый образец.

Перенесите по 10 µL смеси для реакции переваривания в пробирки для переваривания. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение шести часов или в течение ночи. На следующий день подготовьте восемь реакций лигирования линкеров в пробирках объемом 1,5 мл.

Для каждой реакции добавьте смесь для лигирования к 10 µL переваренной геномной ДНК. Инкубируйте при 16 °C от трех до шести часов. Для первого раунда ПЦР подготовьте 48 ПЦР-реакций в пробирках объемом 0,2 мл.

Для каждой ПЦР добавьте реакционную смесь, содержащую линкерный праймер и праймер MLV3 prime LTR, к двум микролитрам продукта реакции лигирования. Поместите образцы в амплификатор с подогреваемой крышкой. Установите параметры циклирования и проведите первый раунд ПЦР.

Для второго раунда ПЦР подготовьте реакционную смесь, содержащую вложенный праймер к линкеру и вложенный праймер MLV3 prime LTR. Затем добавьте 2 µL продукта ПЦР первого раунда в качестве матрицы. После этого проведите реакцию ПЦР второго раунда для получения конечных продуктов LN-ПЦР.

После второго раунда ПЦР объедините 48 реакций вложенной ПЦР с LM-адаптерами в пробирке объемом 15 мл. Затем добавьте 20 µL буфера для нанесения к 100 µL объединенного и осажденного продукта ПЦР с LM-адаптерами. Нанесите образец на 1% агарозный гель вместе с маркером длин ДНК 100 bp.

Проводите электрофорез в геле при напряжении 5 В/см в течение 30–60 минут. После разделения полос вырежьте область геля, содержащую ампликоны длиной от 150 до 500 п.н. После очистки продукта LM-ПЦР с помощью набора для экстракции из геля на основе колонок измерьте концентрацию с помощью УФ-спектрофотометра перед переходом к подготовке библиотек. Также оцените длину продуктов LM-ПЦР с помощью биоанализатора в соответствии с инструкциями производителя.

Подготовьте библиотеку, проведя индексирующую ПЦР. Для каждой ПЦР используйте от 150 до 170 нанограмм очищенного продукта ПЦР LM, применяя разные комбинации индексов для каждого образца. Проведите ПЦР в амплификаторе с подогреваемой крышкой согласно указаниям.

После ПЦР разведите очищенную библиотеку до концентрации 10 nanomolar с использованием 10 millimolar tris HCL. Затем смешайте пять µL разведенного пула с пятью µL 0.2 N гидроксида натрия в новой пробирке объемом 1.5 mL. Кратковременно перемешайте на вортексе, центрифугируйте и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре для денатурации библиотек.

Поместите пробирки с денатурированным пулом на лед и добавьте 990 µL предварительно охлажденного гибридизационного буфера HT1. Затем перенесите аликвоту объемом 300 µL денатурированного пула в новую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 300 µL предварительно охлажденного HT1, чтобы получить финальную концентрацию пула библиотек 10 pM.

Параллельно смешайте 10 нМ фиксированной контрольной библиотеки в объеме 2 мкл с 3 мкл 10 мМ tris HCl в пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 5 мкл 0,2 н гидроксида натрия и коротко перемешайте на вортексе. После центрифугирования выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре для денатурации разведенного фиксатора.

После инкубации поместите пробирку на лед и добавьте 990 µL охлажденного HT1. Затем перенесите аликвоту 100 µL денатурированного fix в новую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 300 µL охлажденного HT1, чтобы получить конечную концентрацию fix 10 pM. Наконец, в новой пробирке объемом 1,5 мл смешайте 510 µL денатурированного пула библиотек с 90 µL денатурированной фиксированной библиотеки, таким образом получив конечный пул с концентрацией 10 pM, содержащий 15% контроля fix, для последующего секвенирования.

На этом изображении представлен анализ 3498, 2989 и 4103 кластеров повторяющихся сайтов интеграции MLV в гемопоэтических стволовых клетках-предшественниках, эритроидных предшественниках и миелоидных предшественниках соответственно. В каждой популяции клеток более 95% кластеров MLV перекрывались с эпигенетически определенными энхансерами и промоторами. Клеточно-специфические области-мишени MLV были сильно ацетилированы и ассоциированы с клеточно-специфической экспрессией целевого гена.

Примерами являются промотор гена SPINK2, специфичный для HSP. Локус-контрольный регион, содержащий мощные энхансеры генов бета-подобных глобинов, специфичных для эритроидных клеток. Энхансеры, расположенные выше по течению от гена LYZ, специфичного для NPP.

Люциферазные репортерные анализы подтвердили специфичность подмножества мишеней MLV для энхансеров в EPP и MPP. Эритроид-специфичные области, нацеленные на MLV, проявляли более высокую активность в EPP, чем в MPP, и наоборот, что подтверждает способность MLV идентифицировать клеточно-специфичные энхансеры, которые, возможно, контролируют экспрессию соседних генов. После освоения эта методика может быть выполнена за одну неделю при условии правильного соблюдения протокола.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости максимально увеличить частоту трансдукции клеток для оптимального извлечения сайтов интеграции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как картировать сайты вирусной интеграции, сначала подготовив геномную ДНК, затем лигируя геномные фрагменты с ДНК-линкером, далее амплифицируя junction-последовательности вируса и генома хозяина с помощью LM-ПЦР и, наконец, проводя глубокое секвенирование библиотеки ампликонов.