Автоматизированный анализ хемосенсорного предпочтения на основе нематод

Общая цель данной настройки и протокола записи поведения заключается в количественной оценке хемосенсорных предпочтений C Elegans в отношении растворимых соединений на основе популяции с использованием многокамерной системы сбора видеоданных с последующим автоматическим анализом видео. Этот метод может облегчить нейробиологические исследования C Elegans, обеспечивая более быстрый и стандартизированный поведенческий анализ генетических мутантов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что несколько реплик могут быть проанализированы одновременно в идентичных условиях, при этом отслеживается временная динамика реакции популяции нематод на растворимые сигналы.

Демонстрировать сборку поведенческой камеры будет Кристофер Кронин, штатный научный сотрудник этой лаборатории. Для начала подготовьте тканевые чехлы, планки крепления камеры, угловые кронштейны, экструзионные планки и узел крепления камеры, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Начиная с торцевых стержней, прикрепленных к центральной планке, прикрепите подставку для камеры и кобуры к узлу крепления камеры.

Далее соберите раму поведенческой камеры. Начните с прикрепления четырех экструзионных алюминиевых стержней на один фут к квадратному листу полиэстера. Наденьте одну планку на две Т-образные гайки всестороннего листа ткани, центрируя планку по ширине ткани.

Затяните застежки, чтобы закрепить тканевый лист на каждой перекладине. Расстелите квадратный лист полиэстера на рабочей поверхности с четырьмя прикрепленными алюминиевыми стержнями сверху. Затем наденьте восемь угловых кронштейнов на верхние поверхности четырех алюминиевых стержней, по одному на каждом конце каждого стержня.

Расположите угловые кронштейны на стержнях так, чтобы вертикальные ножки кронштейна были заподлицо с концами стержней, и закрепите их на месте, затянув винты в Т-образных гайках. В каждом углу встаньте вертикально на одну ногу алюминиевого профиля, надев экструзию на Т-образные гайки на двух ножках углового кронштейна. Затем закрепите вертикальный брусок на горизонтальных брусьях, затянув крепежные элементы, соединив таким образом два соседних турника.

Вставьте ослабленные Т-образные гайки узла крепления H-образной камеры в стойку рамы. Пусть буква H проскользнет до упора вниз, чтобы она легла на верхнюю часть угловых кронштейнов в каждом углу рамы. Закрепите крепление камеры в сборе, затянув четыре винта углового кронштейна.

Затем используйте эти последние четыре алюминиевых стержня для экструзии на один фут для сборки нижнего слоя камеры. Расположите угловые кронштейны так, чтобы ножки кронштейнов были заподлицо с концом стержня, и затяните винты, чтобы зафиксировать его на месте. Затем проденьте стержни между стойками рамы с ослабленными Т-образными гайками в вертикальных каналах.

Расположите перекладину так, чтобы верхние края их угловых кронштейнов были на один дюйм ниже открытого конца стоек, и закрепите на месте, затянув винты углового кронштейна. Затем сдвиньте Т-образные гайки четырех прямоугольных листов полиэстера вниз в каналы вертикальных экструзионных стержней, чтобы покрыть боковые стороны камеры, и затяните крепления, чтобы закрепить их на месте. Выберите одну сторону в качестве двери для доступа внутрь камеры и снимите два винта и Т-образные гайки в нижнем слое камеры.

Поместите пластиковый колпачок на верхний конец каждого угла, чтобы он служил ножками для готовой рамы. Переверните раму правой стороной вверх и вставьте два держателя панелей на каждом слайде внутрь слоя пространства рамки и поверните, чтобы зафиксировать их на месте. Затем поместите кусок прозрачного акрила размером 12 на 12 дюймов поверх держателей панелей, чтобы обеспечить сцену для пробирных пластин.

Наконец, расположите камеру и шаблон сцены, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. За день до эксперимента поместите 28 пустых 35-миллиметровых пластин в стопки по пять или менее на плоскую поверхность. Заполните каждую тестовую пластину пятью миллилитрами агара для роста нематоды и оставьте пробирные пластины сушиться в вертикальном положении со снятыми крышками на ночь при комнатной температуре.

В день эксперимента включите подсветку, загрузите компьютер и запустите программное обеспечение для видеосъемки камеры микроскопа. Подключите камеру микроскопа к компьютеру и нажмите на пронумерованную миниатюру камеры в верхней части окна программного обеспечения, чтобы просмотреть прямую трансляцию с камеры. Чтобы настроить параметры записи видео, потяните вниз меню формата видео в верхнем левом углу камеры и выберите MJPG 1280x1024.

Затем потяните вниз меню папок рядом с меню формата видео и выберите папку, в которой будете сохранены видеофайлы. Нажмите на значок автоэкспозиции в правом верхнем углу ленты камеры и отключите автоэкспозицию. Затем нажмите на значок светодиода справа от значка автоматической экспозиции, чтобы выключить встроенные светодиоды камеры микроскопа.

Нажмите на значок соседних настроек и выберите, монохромный. Увеличьте контрастность и отрегулируйте яркость. Выровняйте шаблон размещения решения поверх шаблона выравнивания сценической плиты и нажмите на значок записи таймлапс-видео в левой части камеры камеры.

Введите пять секунд в качестве длительности и одну секунду в качестве интервала для записи пятисекундного калибровочного видео со скоростью один кадр в секунду. Используйте стеклянную пипетку объемом пять миллилитров, чтобы добавить 1,2 миллилитра буфера для роста нематоды в тарелку с синхронизированными червями и осторожно перемешайте пластину, чтобы вытеснить червей в буфер. Отпидайте буфер от планшета и распределите червей в буфере в чистую микроцентрифужную пробирку.

Дайте трубкам постоять одну-две минуты, чтобы черви осядли на дно. Затем с помощью пластикового наконечника для пипетки удалите как можно больше буфера для промывки из пробирок, не потревожив гранулы агрегированных червей на дне пробирок. Наполните тюбик одним миллилитром буфера чистой питательной среды для нематоды и повторите процедуру промывки еще два раза.

Затем приклейте скотчем шаблон для размещения раствора поверх предметного столика препарирующего микроскопа. Затем поместите полоску двустороннего скотча с обеих сторон шаблона для выравнивания пластин. Совместите периметр пробирной пластины с кругом на шаблоне для выравнивания пластины и надавливайте до тех пор, пока шаблон не прилипнет к нижней части пластины.

Затем совместите маркеры элементов шаблона пробирного планшета с маркерами элементов шаблона размещения раствора на препарирующем микроскопе. Затем с помощью пипетки P2 поместите один микролитр буфера M13, каждый из которых находится в первом и четвертом квадрантах. С помощью нового наконечника поместите по одному микролитру 10 миллимолярного раствора CuCl2 во второй и третий квадранты.

Используйте стеклянную пастеровскую пипетку, чтобы перенести промытых червей в пробирные планшеты после того, как капли раствора полностью впитаются в агар. Поместите каплю червей на участки выше и ниже круглых обработанных участков. Сложите ткань в четыре раза и тупым краем впитайте излишки буфера для промывки на пластинах для анализа.

Немедленно расположите пробирные пластины под камерами микроскопа в поведенческой камере, выровняв номера углов шаблона. Подождите две-три минуты, чтобы черви акклиматизировались к пробирным пластинам. Затем нажмите на значок записи таймлапс-видео в левой части камеры и введите 10 минут для длительности и одну секунду для интервала, чтобы записать 10-минутное видео с одним кадром в секунду.

Наконец, нажмите «Пуск», чтобы начать запись видео. Для каждого видеокадра функция индекса предпочтений подсчитывает количество червячных пикселей в каждой интересующей области и вычисляет процент одного пикселя от общего числа пикселей в интересующей области. Приведены значения индекса предпочтения, полученные для различных генотипов и пар лечения.

Положительное значение индекса предпочтений указывает на влечение к лечению, в то время как отрицательное значение индекса предпочтения указывает на отвращение. Индекс предпочтения 0,02 получен при размещении буферного раствора M13 как в контрольной, так и в экспериментальной областях, что свидетельствует об отсутствии пространственного смещения. Этот график также показывает, что черви N2 сильно избегали ионов меди, в результате чего индекс предпочтения составил 0,67.

Кроме того, osm-3, которые имеют дефекты в формировании сенсорных ресничков, и мутанты ocr-2, которые дефектны в ноцицептивных реакциях, опосредованных ASH, показали снижение избегания и даже некоторое умеренное влечение к ионам меди. При использовании этого протокола важно работать быстро, но при этом плавно и последовательно. Настройка записи и протокол анализа могут быть легко адаптированы для характеристики популяционных поведенческих реакций, возникающих в результате взаимодействия между различными сенсорными разновидностями C Elegans.