Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Общей целью переноса генов аденоассоциированного вирусного вектора является генетическое манипулирование головным и спинным мозгом крысы в широких масштабах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области переноса генов. Это очень эффективный способ введения генов in vivo и, следовательно, очень мощный, очень универсальный метод.

Эта процедура является быстрой и легко воспроизводимой. Мы использовали этот широкомасштабный подход к переносу генов для экспрессии белка, связанного с боковым амиотрофическим склерозом, по всему спинному мозгу крыс в нескольких публикациях. Мой коллега Роберт Дейтон продемонстрирует эту процедуру.

Михал Грамес будет помогать Роберту. Начните с подготовки рабочей станции, сначала очистите поверхность 70% этанолом. Затем поместите грелку в рабочую зону и установите ее на тепло до 37 градусов по Цельсию.

Положите сверху на грелку скамейку. Убедитесь, что для проведения процедуры достаточно кислорода и изофлурана. Очистите индукционную камеру и маску для анестезии 70% этанолом и положите маску для анестезии на подушку для скамьи.

Убедитесь, что под рукой имеются: один квадрат парафиновой пленки размером примерно 5 х 5 сантиметров на животное, одна салфетка для приготовления спирта и две или три марлевые салфетки на животное, наконечники для пипетки и микропипетка. Затем разморозьте вектор при комнатной температуре и пометьте по одной стерильной микроцентрифужной пробирке для каждого животного. Наведите пипеткой необходимый объем AAV в соответствующую пробирку и доведите объем до желаемого объема инъекции с помощью раствора лактата Рингера или физиологического раствора.

Поместите образец на вихревую поверхность в течение одной или двух секунд, а затем импульсируйте центрифугой в течение пяти секунд, чтобы довести образец до дна пробирки. Выведите пипеткой общий объем инъекции из пробирки на квадрат парафиновой пленки. Далее поместите иглу 30 калибра на одномиллилитровый шприц.

Поместите иглу фаской вниз в вектор на парафиновую пленку. Потяните поршень шприца назад, пока весь вирус не окажется в игле и шприце. Правильно обезболить крысу можно с помощью наркозной системы.

Обеспечить адекватную плоскость анестезии за счет отсутствия реакции на защемление пальца ноги. Затем поместите крысу в рабочую зону на бок и поддерживайте анестезию с помощью носового конуса. Когда крыса лежит на боку, одна боковая хвостовая жилка должна быть обращена вверх.

Инъекция делается на две трети вниз по длине хвоста. Протрите место инъекции спиртовой салфеткой. Крепко держите хвост немного выше области инъекции, одним пальцем прямо над боковой хвостовой веной, это расширит вену.

Скосом вверх совместите иглу с видимой хвостовой веной в том же направлении. Прокалывайте кожу над хвостовой веной, при этом очень осторожно, чтобы другая рука не держала хвост и не надавливала на хвостовую вену. Ослабьте давление на хвостовую вену, чтобы обеспечить нормальный кровоток.

Затем введите иглу в вену. Чтобы убедиться, что игла проколола хвостовую вену, слегка оттяните поршень назад. Если игла находится в вене, кровь будет поступать в иглу.

После изменения положения иглы, если это необходимо, стабилизируйте иглу, прижав конец шприца к хвосту. Медленно вводите вектор в хвост со скоростью примерно 20 микролитров в секунду. В случае плохой инъекции животное будет трансдуцировано лишь частично, и результаты, вероятно, не будут полезными.

Однако, с практикой, хорошие инъекции очень воспроизводимы и надежны. Если вектор был введен, извлеките иглу из хвоста и прижмите марлевую салфетку к месту инъекции, чтобы остановить кровотечение на 30–60 секунд. Выключите изофлурановую анестезию и кислород.

Наблюдайте за крысой, пока она не придет в сознание, а затем верните ее в клетку. Выбросьте материалы, которые могут быть загрязнены AAV, в соответствующий контейнер для биологически опасных веществ и очистите рабочую станцию 70% этанолом. Получение корональных срезов размером 50 микрон из неподвижного и криозащищенного мозга животного, которому вводили AAV, с помощью скользящего микротома со стадией замораживания.

После иммуноокрашивания на GFP и установки на предметные стекла сделайте микрофотографию каждого среза в определенной области интереса с помощью объектива с малым увеличением с помощью микроскопа. Сохраняйте одинаковые настройки камеры для всех анализируемых образцов и сохраняйте данные в виде файлов TIFF. Откройте микрофотографию в широко доступной программе Scion Image.

Откроются два окна, закройте окно, обозначенное индексным цветом. Выберите параметры, затем срез плотности. Диапазон оттенков будет обозначен красным цветом в окне таблицы поиска.

В окне используйте курсор только для заполнения конкретной маркировки GFP и остановитесь, когда на изображении начнет выделяться неспецифический фон. Затем нажмите «Анализировать» и установите масштаб. В четвертой строке должно быть написано «единицы измерения», из выпадающего списка выберите пиксели, затем нажмите «ОК».

Чтобы измерить флуоресцентную область, нажмите «Анализ», а затем «Измерить». Затем нажмите «Анализировать» и показать результаты. Появится окно с результатами, а измерение флуоресцентной площади будет находиться под заголовком с меткой «площадь».

После того, как все измерения будут записаны, усредните значения от трех до шести секций на животное. Используйте соответствующий статистический тест для сравнения трансдуцированных областей между группами. На этом репрезентативном изображении показана иммунофлюоресценция GFP в мозжечке крысы через четыре недели после инъекции AAV 9 GFP в хвостовую вену.

Программное обеспечение для анализа изображений использовалось для выборочного выделения флуоресцентной области и количественной оценки выделенных пикселей. Это изображение в формате GFP, полученное от животного, не подвергавшегося воздействию вируса. Анализ этого изображения с использованием тех же параметров для животного, которому вводили GFP, обнаруживает очень низкий уровень фонового сигнала.

После освоения инъекция может быть сделана примерно за пять минут для каждой крысы. В заключение, этот метод описывает способ эффективного введения генов в ЦНС крысы, единовременная доставка генов обеспечивает длительную экспрессию и долгосрочные эффекты. Самое главное, что управление центральной нервной системой происходит с периферии.

Относительно неинвазивная внутривенная векторная инъекция, достигает головного и спинного мозга, ЦНС.