Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Общая цель данного переноса генов с помощью вектора на основе аденоассоциированного вируса заключается в генетическом манипулировании головным и спинным мозгом крысы в обширном масштабе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области переноса генов. Он представляет собой очень эффективный способ введения генов in-vivo и, следовательно, является очень мощным и универсальным методом.

Данная процедура является быстрой и высоковоспроизводимой. В нескольких публикациях мы использовали этот метод широкомасштабного переноса генов для экспрессии белка, связанного с боковым амиотрофическим склерозом, во всем спинном мозге крыс. Мой коллега Роберт Дейтон продемонстрирует выполнение этой процедуры.

Майкл Грэмс будет помогать Роберту. Начните с подготовки рабочего места: сначала очистите поверхность 70% этанолом. Затем поместите нагревательный коврик в рабочую зону и установите температуру нагрева 37 °C.

Положите лабораторный коврик поверх нагревательной подушки. Убедитесь, что для проведения процедуры имеется достаточное количество кислорода и изофлурана. Очистите индукционную камеру и анестезиологическую маску 70% ethanol и положите анестезиологическую маску на лабораторный коврик.

Убедитесь, что в наличии имеются следующие принадлежности: квадрат парафиновой пленки размером примерно 5 x 5 сантиметров на одно животное, одна спиртовая салфетка и две или три марлевые салфетки на одно животное, наконечники для пипеток и микропипетка. Затем разморозьте вектор при комнатной температуре и промаркируйте одну стерильную микроцентрифужную пробирку для каждого животного. Перенесите с помощью пипетки необходимый объем AAV в соответствующую пробирку и доведите объем до требуемого значения для инъекции, используя раствор Рингера с лактатом или физиологический раствор.

После перемешивания образца на вортексе в течение одной или двух секунд кратковременно центрифугируйте его в течение пяти секунд, чтобы осадить образец на дно пробирки. Перенесите весь объем инъекции из пробирки на квадрат парафиновой пленки. Затем установите иглу 30G на шприц объемом 1 мл.

Введите иглу срезом вниз в вектор на парафиновой пленке. Оттяните поршень шприца, пока весь вирус не окажется в игле и шприце. Проведите надлежащую анестезию крысы с помощью системы для наркоза.

Убедитесь в достижении достаточного уровня анестезии по отсутствию реакции на щипок за палец лапы. Затем поместите крысу на бок в рабочую зону и поддерживайте анестезию с помощью носового конуса. При таком положении крысы одна из латеральных хвостовых вен должна быть обращена вверх.

Инъекцию проводят на уровне двух третей длины хвоста. Протрите место инъекции спиртовой салфеткой. Плотно зажмите хвост чуть выше области инъекции, прижав один палец непосредственно над латеральной хвостальной веной, чтобы расширить вену.

Удерживая иглу срезом вверх, направьте её вдоль видимой хвостовой вены. Проколите кожу над хвостовой веной, стараясь не задеть руку, удерживающую хвост, и не сдавливать вену. Ослабьте давление на хвостовую вену, чтобы восстановить нормальный кровоток.

Затем введите иглу в вену. Чтобы убедиться, что игла проколола хвостовую вену, слегка потяните поршень на себя. Если игла находится в вене, в нее начнет поступать кровь.

После repositioning иголки (при необходимости) зафиксируйте её, прижав конец шприца к хвосту. Медленно введите вектор в хвост со скоростью примерно 20 µL в секунду. В случае неудачной инъекции животное будет трансдуцировано лишь частично, и результаты, скорее всего, окажутся бесполезными.

Однако при наличии опыта инъекции становятся очень воспроизводимыми и надежными. После введения вектора извлеките иглу из хвоста и прижмите к месту инъекции марлевую салфетку на 30–60 секунд, чтобы остановить кровотечение. Выключите подачу изофлурана и кислорода.

Наблюдайте за крысой до тех пор, пока она не придет в сознание, после чего верните ее в клетку. Утилизируйте материалы, которые могли быть контаминированы AAV, в соответствующий контейнер для биоопасных отходов и обработайте рабочую поверхность 70% ethanol. Используя скользящий микротом с охлаждаемым столом, получите корональные срезы толщиной 50 micron из фиксированного и криопротектированного мозга животного, которому был введен AAV.

После иммуноокрашивания на GFP и закрепления на предметных стеклах сделайте микрофотографии каждого среза в определенной области интереса, используя микроскоп с объективом малого увеличения. Сохраняйте одинаковые настройки камеры для всех анализируемых образцов и сохраняйте данные в виде файлов TIFF. Откройте микрофотографию в общедоступной программе Scion Image.

Откроются два окна; закройте окно с пометкой index color. Выберите options, затем density slice. Диапазон оттенков будет выделен красным цветом в окне таблицы поиска (look up table).

В окне с помощью курсора выделите только области со специфическим мечением GFP, прекратив выделение, когда на изображении начнет проявляться неспецифический фон. Затем нажмите «analyze» и выберите «set scale». В четвертой строке, где указаны единицы измерения (units), выберите в выпадающем списке «pixels» и нажмите «okay».

Чтобы измерить область флуоресценции, нажмите analyze, а затем measure. После этого нажмите analyze и show results. Появится окно с результатами, в котором значение площади флуоресценции будет указано под заголовком area.

После записи всех измерений вычислите средние значения для трех-шести срезов от каждого животного. Для сравнения областей трансдукции между группами используйте подходящий статистический критерий. На данном репрезентативном изображении показана иммунофлуоресценция GFP в мозжечке крысы через четыре недели после инъекции AAV 9 GFP в хвостовую вену.

Для выборочного выделения флуоресцирующей области и количественного определения выделенных пикселей использовалось программное обеспечение для анализа изображений. На данном изображении представлен GFP-сигнал от не трансдуцированного животного. Анализ этого изображения с использованием тех же параметров, что и для животного, которому вводили GFP, выявляет очень низкий уровень фонового сигнала.

После освоения процедура инъекции занимает около пяти минут на одну крысу. В заключение отметим, что данный метод описывает способ эффективного введения генов в ЦНС крысы, при котором однократная доставка гена обеспечивает стойкую экспрессию и долгосрочный эффект. Что наиболее важно, воздействие на центральную нервную систему осуществляется через периферию.

Относительно малоинвазивная внутривенная инъекция вектора позволяет доставить его в головной и спинной мозг, то есть в ЦНС.