Передовые методы Confocal микроскопии для изучения кинетики в повреждения ДНК и белок белковых взаимодействий
12 ноября 2017 г.
Лазерная microirradiation является полезным инструментом для исследования ДНК ремонта в живых клетках. Методологический подход к использования УФ лазеров чтобы побудить различные поражения ДНК показано. Мы оптимизировали метод для местных microirradiation, который поддерживает нормальное клеточного цикла; Таким образом облученных клеток перейти через митоз.
Общая цель этих экспериментов состоит в том, чтобы индуцировать повреждения ДНК с помощью локального микрооблучения клеток и наблюдать за рекрутированием белков, участвующих в процессах репарации ДНК. Этот метод может помочь нам понять очень сложный и глубокий вопрос, например, как нормальные и раковые клетки реагируют на повреждение ДНК. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем изучать реакцию на повреждение ДНК в отдельных живых клетках. Демонстрировать процедуру будут Сона Легартова, постдок, и Яна Сучанкова, аспирант из моей лаборатории. Для начала культивируйте клетки HeLa в DMAM с добавлением 10% FBS и соответствующих антибиотиков. Инкубация клеток при 37
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Лазерное микрооблучение представляет собой ценный метод исследования механизмов репарации ДНК в живых клетках. В данном исследовании представлен оптимизированный метод использования лазеров UVA-диапазона для индукции специфических повреждений ДНК при сохранении нормального течения клеточного цикла.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Репарация ДНК
- Клеточная биология
- Лазерное микрооблучение
Теоретическая часть
- Понимание процессов репарации ДНК имеет решающее значение для изучения клеточных ответов на повреждения.
- Лазерное микрооблучение позволяет точно индуцировать повреждения ДНК.
- Поддержание нормального клеточного цикла необходимо для точного изучения механизмов репарации.
- Лазеры UVA-диапазона эффективны для создания локальных повреждений ДНК.
Цель исследования
- Оптимизировать метод локального микрооблучения с использованием UVA-лазеров.
- Исследовать влияние индуцированных повреждений ДНК на прохождение клеточного цикла.
- Углубить понимание процессов репарации ДНК в живых клетках.
Используемые методы
- Использование UVA-лазеров для микрооблучения.
- Мониторинг прохождения клеточного цикла после облучения.
- Оценка механизмов репарации ДНК в облученных клетках.
- Сравнение поведения нормальных и облученных клеток.
Основные результаты
- Оптимизированный метод микрооблучения успешно индуцировал повреждения ДНК.
- Клетки сохраняли нормальное прохождение клеточного цикла, несмотря на облучение.
- Была достигнута эффективная оценка механизмов репарации ДНК.
- Полученные результаты способствуют пониманию клеточных ответов на повреждение ДНК.
Выводы
- Оптимизированный метод микрооблучения UVA-лазером эффективен для изучения репарации ДНК.
- Поддержание нормального клеточного цикла имеет решающее значение для получения точных результатов эксперимента.
- Данный подход может быть применен в дальнейших исследованиях повреждения и репарации ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Современная конфокальная микроскопия в сочетании с лазерным микрооблучением позволяет точно исследовать в живых клетках белок-белковые взаимодействия и кинетику репарации в местах повреждений ДНК. Эта возможность имеет решающее значение для снижения рисков при проверке гипотез на ранних этапах поиска путей ответа на повреждение ДНК и для повышения прогностической уверенности при валидации мишеней. Данный подход обеспечивает трансляционную преемственность, позволяя проводить механистические исследования в клеточных контекстах, имеющих значение для патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую наблюдать за рекрутированием белков и динамикой их взаимодействия в местах повреждения ДНК в живых клетках.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней репарации ДНК путем количественного анализа кинетики и задействования путей.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет дифференциации ответов, зависящих от фазы клеточного цикла, с использованием системы Fucci.
- Предоставляет доказательства селективности путей и взаимодействия с мишенями в моделях, имеющих значение для заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированные системы с живыми клетками для количественной оценки кинетики и взаимодействий белков.
- Обеспечивает стандартизацию анализа за счет воспроизводимого индуцирования повреждений ДНК с заданными параметрами лазера.
- Обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга модуляторов, влияющих на динамику белков репарации ДНК.
- Предоставляет количественные данные с помощью методов FRAP, FLIM и FLIM-FRET для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет механистические данные с фенотипами репарации ДНК, значимыми для развития заболеваний в раковых и нормальных клетках.
- Способствует поиску биомаркеров, связывая кинетику белковых взаимодействий с клеточными эффектами после повреждения.
- Обеспечивает продвижение с учетом рисков, предоставляя прогностические данные о модуляции путей репарации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная методология охватывает все этапы — от начального поиска до идентификации ведущих соединений, обеспечивая возможность как проверки гипотез, так и количественного скрининга в системах с живыми клетками.
- Биология открытий: обеспечивает анализ привлечения и взаимодействия белков в местах повреждения ДНК в режиме реального времени для выяснения механизмов сигнальных путей.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные показатели кинетики и взаимодействий белков для разработки методов анализа.
- Аналитика: использует методы FRAP, FLIM и FLIM-FRET для получения сравнительных данных о кинетике и взаимодействиях при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает механистическое поведение белков с фазой клеточного цикла и результатами репарации ДНК в соответствующих моделях.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульную платформу, адаптируемую к различным мишеням репарации ДНК и клеточным системам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней восстановления ДНК и деконволюции путей.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы индукции повреждений ДНК в живых клетках и количественного анализа белков.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя механистические доказательства взаимодействия с мишенью и модуляции путей.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней и механизмов восстановления ДНК для дальнейшей разработки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с передовыми методами конфокальной микроскопии и визуализации живых клеток.
- Необходим доступ к платформам для лазерного микрооблучения и инфраструктуре для количественной визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров облучения и протоколов кинетического анализа.
- Адаптация для различных типов клеток может потребовать оптимизации настроек лазера и маркеров клеточного цикла.
- При интерпретации кинетических данных и данных о взаимодействиях необходимо учитывать фазу клеточного цикла и тип повреждения ДНК.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cultivation of HeLa-derived Cell Lines
1:48
Cell Transfection
3:21
Induction of Local DNA Lesions and Confocal Microscopy
4:47
Fluorescence Lifetime Image Microscopy
6:24
FRET Efficiency Using the FLIM-FRET Script
7:48
FRAP Analysis
8:50
Results: Analysis of Recruitment of mCherry-tagged PCNA and -53BP1 at DNA Lesions in HeLa Cells
11:00
Conclusion
