Определение сиаловых кислот в образцах печени и молока дикого типа и

Общая цель данной методики заключается в определении содержания N-ацетилнейраминовой кислоты и N-гликолилнейраминовой кислоты в печени и молоке мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена CMAH с помощью анализа методом ВЭЖХ. Этот метод позволяет ответить на вопросы в области гликобиологии, в частности, о влиянии генотипов моделей мышей CMAH на фактическое содержание сиаловых кислот у этих животных. Основным преимуществом данной методики по сравнению с генетическим скринингом является возможность определения относительного уровня сиаловых кислот и для гетерозиготных мышей.

Оценку данного метода проведут Цуй Цао и Ван Вэньцзяо, два аспиранта нашей лаборатории. Начните выполнение данной процедуры со сбора молока и тканей печени мышей с нокаутом CMAH, как описано в текстовом протоколе. Для выделения сиаловых кислот из молока перенесите 50 µL молока в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 1,2 мл приготовленного водного раствора уксусной кислоты.

Для выделения сиаловых кислот из ткани печени осторожно разморозьте 20–50 мг печени мыши и перенесите её в гомогенизатор Dounce. Добавьте 1,2 мл водного раствора уксусной кислоты и гомогенизируйте ткань путем осторожного сдвига в течение 10 секунд. Перенесите полученную суспензию в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Затем инкубируйте подкисленное молоко или суспензию ткани в течение четырех часов при 80 °C. После этого центрифугируйте образец при 14 000 ×g в течение 10 минут. Перенесите верхние 1000 µL супернатанта в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Удалите растворитель путем центрифужного испарения при комнатной температуре до полного высушивания. Растворите образец повторно в 500 µL дистиллированной воды. Затем подготовьте микроанионообменную колонку, перенеся 200 mg анионообменной смолы на один образец в пустые пробирки объемом 3 mL с прикрепленным краном.

Добавьте 2 milliliters водного раствора уксусной кислоты, чтобы заменить хлорид-ионы в смоле на ацетат-ионы. Закройте кран, как только растворитель достигнет верхней границы смолы. Осторожно добавьте 2 milliliters дистиллированной воды и откройте кран.

Остановите поток, как только большая часть растворителя достигнет верхней части смолы. Убедитесь, что смола всегда покрыта растворителем. Затем промойте колонку со смолой еще два раза, используя по 2 mL дистиллированной воды, для удаления излишков ацетата.

Перенесите полученные 500 µL растворителя с образцом на смоляную колонку и удалите фильтрат. Осторожно промойте смолу 2 mL дистиллированной воды. Элюируйте анионы образца со смолы, используя 1 mL 50 mM раствора ацетата аммония, в центрифужную пробирку объемом 1.5 mL.

Удалите растворитель путем центрифугирования при комнатной температуре до полного высыхания. Взвесьте от 5 до 8 миллиграммов N-Acetylneuraminic acid на аналитических весах в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Запишите точный вес и добавьте 164 микролитра дистиллированной воды на каждый миллиграмм.

Приобретите N-гликоллилнейраминовую кислоту в небольших количествах по доступной цене, например, в аликвотах по 1 milligram. Добавьте 154 µL дистиллированной воды непосредственно к соединению, чтобы получить стоковый раствор Neu5Gc с концентрацией примерно 20 mM. Перенесите раствор в центрифужную пробирку объемом 1.5 mL.

Данный раствор можно хранить при температуре -20 °C до 12 месяцев. Смешайте по 5 µL каждого стокового раствора в новой центрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем удалите растворитель путем центрифужного испарения при комнатной температуре до полного высыхания.

Добавьте 20 µL раствора OPD к образцам сиаловой кислоты, полученным из молока мыши, печени мыши или к смешанному стандарту сиаловой кислоты. Интенсивно перемешайте образец на вортексе в течение 30 секунд. Затем инкубируйте образцы в течение четырех часов при 80 °C в темноте.

После охлаждения образцов в течение пяти минут добавьте 80 µL дистиллированной воды. Затем центрифугируйте пробирки при 14 000 ×g в течение одной минуты. После этого перенесите 80 µL супернатанта в пробирку для ВЭЖХ с высоким выходом объемом 300 µL.

Образцы дериватизированной сиаловой кислоты можно хранить при температуре от четырех до шести градусов Цельсия до одной недели. Анализ образцов проводят с использованием стандартной системы ВЭЖХ, подключенной к онлайн-флуориметрическому детектору. Для анализа используют обращенно-фазовую колонку C18 длиной 250 миллиметров и диаметром 4,6 миллиметра.

После приготовления растворителя A и растворителя B, а также настройки параметров ВЭЖХ согласно протоколу, введите 50 µL образца в систему ВЭЖХ. Контролируйте элюат с помощью флуоресцентного детектора при длине волны возбуждения 373 nm и длине волны эмиссии 448 nm. В завершение рассчитайте относительное количество Neu5Gc, как описано в текстовом протоколе.

Здесь представлены репрезентативные хроматограммы ВЭЖХ флуоресцентно меченных сиаловых кислот из образцов молока, полученных от гомозиготных нокаутных мышей CMAH и гетерозиготных нокаутных мышей CMAH. Также показаны данные для мышей дикого типа. Аналогичным образом здесь представлены хроматограммы флуоресцентно меченных сиаловых кислот, выделенных из печени мыши.

Сравнение относительного количества Neu5Gc показывает, что гомозиготные мыши с нокаутом CMAH не содержат Neu5Gc, в то время как гетерозиготные мыши с нокаутом CMAH и мыши дикого типа содержат от 10 до 75% Neu5Gc. При должном навыке и правильном выполнении процедуры подготовка образцов занимает восемь часов. Анализ образцов с помощью автоматического пробоотборника ВЭЖХ может быть проведен в течение ночи.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что выделение сиаловой кислоты и процедура дериватизации должны проводиться в один и тот же день. После завершения процедуры можно применить другие методы, такие как масс-спектрометрический анализ, для подтверждения природы полученных флуоресцентных сигналов. Разработка этого метода позволяет исследователям изучать распределение сиаловой кислоты в биологических образцах.

Не забывайте, что работа с концентрированной уксусной и муравьиной кислотами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.