Сагиттальная плоскость кинематической походка анализа мышей C57BL/6, подвергается MOG35-55 индуцированной Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

Общая цель этой процедуры заключается в измерении функциональных двигательных нарушений при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите или EAE, мышиной модели рассеянного склероза с использованием кинематического анализа походки. Применение кинематического анализа походки к мышиному поведению было ранее установлено и описано другими авторами. Неврологический дефицит при ЭАЭ возникает в результате нервного воспаления и спорадической потери белого вещества по всему спинному мозгу и мозжечку.

Традиционно моторная стабильность у мышей с ЭАЭ оценивалась с помощью клинических систем оценки, в которых мышам присваивалась клиническая оценка на основе впечатления наблюдателя о тяжести двигательного дефицита. Данные клинических шкал являются порядковыми и плохо коррелируют с гистопатологией спинного мозга. Недавно было показано, что кинематический анализ походки лучше коррелирует с потерей белого вещества, чем клинические показатели, в дополнение к объективному описанию дефицита ходьбы у мышей EAE.

Эта техника включает в себя размещение светоотражающих маркеров на высоких конечностях мышей и позволяет им ходить по беговой дорожке, снимая их с помощью высокоскоростной камеры. Затем кинематические параметры извлекаются из видео с помощью программного обеспечения для анализа движения. Первым делом нужно сделать маркеры, которые будут размещены на задней лапе животного.

Отражение света от этих маркеров позволяет извлекать координаты анатомических точек на ноге из видео. Для начала пробейте нужное количество кружков из листа светоотражающей бумаги. Для каждой мыши требуется пять маркеров на запись, два больших и три маленьких.

С помощью тонких ножниц сделайте надрез, идущий от периметра к центру круга. С помощью тонких щипцов снимите бумажную подложку, чтобы обнажить клейкую поверхность. Возьмитесь за маркер щипцами и с помощью пальца скатайте маркер внутрь себя, чтобы получился конус.

Чтобы сделать небольшой маркер, сделайте более длинный разрез и загните конус более плотно. Чтобы сделать большой маркер, сделайте более короткий разрез и закрутите конус более свободно. С помощью пистолета для горячего клея заполните внутреннюю часть конуса клеем и приклейте его к куску картона.

Важно полностью залить маркер клеем, чтобы предотвратить схлопывание маркера при обращении во время записи. Как только клей высохнет, срежьте маркер с помощью скальпеля. Убедитесь, что вы отрезаете от тела.

Следующим этапом является подготовка животного к учету. Для этого светоотражающие маркеры должны быть прикреплены к задней конечности мыши в соответствующих анатомических местах. Это проводится под легкой анестезией.

Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите 2,5% изофлураном. Когда мышь потеряет сознание, перенесите ее из индукционной камеры в носовой обтекатель или грелку с рециркуляцией воды. Нанесите местную смазку на оба глаза.

Выбрейте желаемую заднюю конечность, простирающуюся от лодыжки до позвоночника и нижней части ребер. В этой демонстрации мы перекодируем движения правой задней конечности, но можно использовать одну или обе конечности. Найдите гребень подвздошной кости, сведя вместе оба колена большим и указательным пальцами и пальпируя чуть ниже ребер.

Отметьте это место с помощью перманентного маркера. Найдите бедро, вытянув ногу и двигая ее вперед и назад. Поместите маркер на тазобедренный сустав, который является точкой сочленения между головкой бедренной кости и тазом.

С помощью гибкой линейки измерьте и запишите длину голени или хвостовика мыши. Измерьте и запишите длину бедренной кости или бедра. Чтобы изолировать четвертый палец для размещения маркера, заклейте остальную часть стопы скотчем.

Возьмитесь за небольшой маркер щипцами и обмакните плоский конец в клей. Поместите маленький маркер на кончик четвертого пальца ноги. Нанесите еще один небольшой маркер на плюснефаланговый сустав.

Поместите последний маленький маркер на щиколотку. Поместите большой маркер на тазобедренный сустав непосредственно над отметиной на коже. Поместите второй большой маркер на отметину над гребнем подвздошной кости.

Снимите ленту с лапки. Поместите мышь в клетку для восстановления и немедленно транспортируйте в комнату для записи походки. Следующий шаг – запись ходьбы мыши по беговой дорожке.

На этом снимке изображена наша система записи на беговой дорожке, на которой видны свет, высокоскоростная камера и беговая дорожка. Прежде чем записывать походку мыши, сфотографируйте калибровочный блок с известными размерами на беговой дорожке. Это позволит преобразовать пиксели в видео в реальные измерения.

Крайне важно, чтобы угол наклона камеры и положение, в котором делается калибровочное изображение, оставались неизменными во время записи поведения при ходьбе. Поместите мышь на беговую дорожку. Постепенно увеличивайте скорость беговой дорожки, чтобы направить мышь в правильном направлении.

Медленно разгоняйтесь до 20 сантиметров в секунду, что является идеальной скоростью бега для получения записей устойчивой походки. Для точного анализа лучше всего записать 8-12 циклов устойчивой ходьбы. Это пример последовательной ходьбы.

Ниже приведено то же видео, которое демонстрируется на половинной скорости. Поскольку мыши ходят очень быстро, может быть полезно просматривать видео с более низкой скоростью, чтобы подсчитывать циклы шагов и лучше оценить характер походки. Это один из примеров того, как мышь EAE ходит по беговой дорожке.

Эта мышь не может выдержать вес своего тела, так как ее таз находится очень низко к земле. Кроме того, он с трудом отрывает ногу от земли во время фазы качания. Это пример другой мыши EAE, которая имеет менее выраженный двигательный дефицит.

Мышь EAE ходит на носочках с ограниченной подвижностью в голеностопном суставе. Это придает мыши неровную походку. Ниже приведены примеры поведения, которые будут дополнять анализ.

Записи, включая эти поведения, не должны использоваться. Задержка возникает, когда мышь перестает ходить и перемещается к задней части беговой дорожки, но затем возобновляет ходьбу. Это может произойти у любой мыши, но будет происходить чаще на более низких скоростях.

Вставание на дыбы происходит, когда мышь перекладывает свой вес на задние конечности и поднимает голову и верхнюю часть туловища. Такое поведение характерно для тревожных мышей. Ниже приведены примеры плохого освещения, которые приведут к проблемам с анализом положения маркеров во времени и пространстве.

Если освещение слишком тусклое, маркеры могут не отражать достаточно света, чтобы быть распознанными компьютерным программным обеспечением. В этом видео метки пальцев ног не так хорошо различимы из-за недостаточного освещения. Если освещение слишком яркое, объекты, отличные от маркеров, могут отражать слишком много света и быть распознаны как маркеры.

В этом видео кажется, что маркеры пальцев ног сливаются с отражающими частями беговой дорожки. Данные отражательных маркеров на идущих мышах могут быть использованы для создания моделей ног из палочек, из которых можно извлечь кинематические параметры. Это запись ходьбы мыши с наложенной палочкой модели ноги.

Обратите внимание, что в этом видео есть шестой маркер на колене, в котором нет необходимости, потому что расположение колена можно триангулировать по позициям тазобедренного и голеностопного суставов, а также по измеренной длине бедренной и большеберцовой костей. Поскольку маркеры над коленным суставом часто неточны из-за соскальзывания кожи, триангуляция является предпочтительным методом. Цикл шага мыши можно разделить на две основные фазы.

Фаза стойки и фаза замаха. С помощью этой диаграммы можно качественно проиллюстрировать движение задней конечности во времени и пространстве. Примером этого может быть оценка движения задней конечности в разные моменты времени на протяжении всего исследования.

В этом примере показано, что задняя нога сжимается во время фазы стойки, что указывает на то, что мышь с трудом выдерживает вес своего тела. Это отражается в усиленном сгибании коленных и голеностопных суставов. В более поздний момент времени это частично восстановилось.

Это видео иллюстрирует взаимосвязь между поведением при ходьбе и углами наклона суставов с течением времени. Формы волн бедра, колена и голеностопного сустава могут быть извлечены из каждой записи. Затем углы соединения могут быть усреднены за восемь-12 последовательных ступенчатых циклов, в результате чего получается средний ступенчатый цикл, который можно использовать для дальнейшего анализа.

Этот график представляет собой форму волны коленного сустава, усредненную из 10 последовательных циклов шага. Данные были нормализованы таким образом, что длина фаз стойки и свинга составляет 100 кадров соответственно. Прозрачный фон представляет фазу качания, а зеленый фон представляет фазу стойки.

У этой мыши поведение при ходьбе из недели в неделю было очень постоянным, а формы волн пошагового цикла из каждой недели значительно перекрывались. Тем не менее, также может наблюдаться значительная вариабельность походки у здоровых мышей, как видно на этом графике. Показанная здесь степень вариативности приемлема и находится в пределах того, что можно было бы ожидать от мыши.

На этом графике представлен цикл шагов колена от мыши EAE, записанный в течение трех недель подряд. Наблюдается небольшое изменение формы цикла шагов на второй неделе и существенное отклонение к третьей неделе, при котором колено мыши гораздо более согнуто и не разгибается во время ходьбы. Существует множество параметров, которые можно измерить с помощью этого метода.

Мы кратко опишем три. Средний угол получается путем усреднения всех углов на протяжении нормализованного шага. В этом случае средний угол уменьшается на протяжении всего исследования, что говорит о том, что мыши не разгибают колени так сильно, как обычно.

Диапазон движения получается путем вычитания наименьшего угла из наибольшего угла в нормализованном ступенчатом цикле. Этот параметр может дать вам представление о гибкости, жесткости или слабости сустава. В этом примере диапазон движений колена уменьшается на протяжении всего исследования, что указывает на то, что мыши не могут нормально двигать коленом, возможно, из-за мышечной слабости.

Среднеквадратичная разность — это метод, используемый для измерения отклонения осциллограмм ступенчатого цикла от базовой записи. Этот параметр говорит о том, насколько сильно отклонение от исходной записи. Кинематический анализ походки является ценным методом, который может быть использован для чувствительного обнаружения и описания изменений в походке.

Применение кинематического анализа походки в исследованиях ЭАЭ может быть ценным инструментом в понимании функциональных последствий патологии спинного мозга в этой модели. Это может способствовать открытию новых методов лечения рассеянного склероза. Кроме того, анализ кинематической походки не ограничивается контекстом ЭАЭ.

Этот метод ранее использовался на мышиных моделях с травмой спинного мозга, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Хантингтона и инсультом, и может быть применен к другим моделям мышей с неврологическими расстройствами, включая болезнь Паркинсона.