Скрининг биоактивных наночастиц в фагоцитарных иммунных клетках для ингибиторов сигнальной сигнальной сигнальной сигнализации

Общая цель этой процедуры скрининга заключается в выявлении новых биоактивных наночастиц, которые могут ингибировать передачу сигналов толл-подобных рецепторов. Этот метод может помочь вам физически идентифицировать новые наноингибиторы, нацеленные на передачу сигналов толл-подобных рецепторов в клетках врожденного иммунитета. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она быстра и надежна, а также проста в использовании систем репортерных ячеек.

Применение этого метода распространяется на терапию многих воспалительных заболеваний, поскольку обнаружено, что передача сигналов толл-подобных рецепторов участвует в патогенезе этих заболеваний. Хотя этот метод может обеспечить высокий уровень скрининга наночастиц золота, он также может быть применен к другим системам наночастиц, а также к терапевтическим малым молекулам и биологиям. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте питательные среды, как указано в текстовом протоколе.

Далее добавьте 100 миллилитров сверхчистой воды, не содержащей эндотоксинов, в чистую стеклянную колбу объемом 125 миллилитров. Добавьте один мешочек секретируемого порошка субстрата эмбриональной щелочной фосфатазы и осторожно взбейте раствор до полного растворения. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа, чтобы обеспечить полное растворение субстратов.

С помощью мембраны толщиной 0,2 микрометра отфильтруйте раствор. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия до готовности к использованию. Затем добавьте один мешочек порошка субстрата люциферазы в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 25 миллилитров ультрачистой воды, не содержащей эндотоксинов.

После того, как порошок полностью растворится, храните при температуре четыре градуса Цельсия до недели до готовности к использованию. Затем приготовьте исходные растворы всех остальных реагентов, как указано в текстовом протоколе. После культивирования и подготовки клеток перенесите их из колбы с культурой в центрифужную пробирку.

Вращайте ячейки в 300 раз G в течение пяти минут. Затем ресуспендируйте их в среде R-10 в концентрации 1 х 10 до 6 клеток на миллилитр. Добавьте аликвоты раствора PMA в клеточную суспензию так, чтобы конечная концентрация составила 50 нанограмм на миллилитр.

Вылейте клеточную суспензию в стерильный резервуар для реагента. С помощью многоканальной пипетки перенесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры с плоским дном. Инкубировать в инкубаторе для клеточных культур в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого с помощью вакуумного аспиратора аккуратно удалите питательную среду. С помощью инвертированного микроскопа проверьте клетки, чтобы убедиться, что полученные макрофаги прилипли на дне лунки. Аккуратно промойте ячейки дважды, используя 100 микролитров PBS на лунку для каждой промывки.

Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей среды R-10. Дайте клеткам отдохнуть двое суток в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия перед проведением репортерного анализа. Во-первых, определите оптимальную дозу ЛПС, указанную в текстовом протоколе.

Далее добавьте 180 микролитров предварительно подогретого раствора Quanti-Blue в каждую лунку новой 96-луночной пластины с плоским дном. Затем перенесите 20 микролитров надосадочной жидкости из каждого образца в пластину. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов, чтобы цвет развился от розового до темно-синего.

После того, как оптическая плотность станет выше единицы, используйте планшетный ридер для определения поглощения на 655 нанометрах. Чтобы начать анализ активации IRF, перенесите 10 микролитров свежей надосадочной жидкости из каждого образца в свежую 96-луночную белую пластину с плоским дном. С помощью автоинъекции добавьте по 50 микролитров раствора люциферазы в каждую лунку.

Затем немедленно соберите люминесценцию скважина за лункой, чтобы получить кривую зависимости дозы и определить оптимальную концентрацию ЛПС для скрининга наночастиц. Далее центрифугируют 20 объемов гибридного раствора пептида-GMP в 1,5 миллилитровых пробирках Эппендорфа при 18 000-кратном G в течение 30 минут. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.

Переложите гибриды в одну свежую пробирку и промойте их дважды одним миллилитром PBS. После этого повторно суспендируйте промытые гибриды в одном объеме среды R-10. Смешайте равные объемы концентрированных гибридов и ЛПС, содержащих среду R-10, таким образом, чтобы конечная концентрация гибридов и ЛПС составляла 100 наномоляров и 10 нанограмм на миллилитр соответственно.

Далее извлеките питательную среду из культивальной пластины макрофагов. Добавьте по 100 микролитров гибридной смеси ЛПС в каждую лунку, по три повтора для каждого условия. Включите отрицательный контроль и контроль LPS.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем переложите среду из каждой лунки в отдельную центрифужную трубку. Центрифугируйте пробирки при температуре 18 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.

Переложите надосадочную жидкость в свежую круглую нижнюю пластину на 96 лунок. Чтобы начать репортерный анализ на этих образцах, добавьте 180 микролитров предварительно подогретого раствора Quanti-Blue в каждую лунку новой 96-луночной пластины с плоским дном. Затем перенесите 20 микролитров надосадочной жидкости из каждого образца в эту пластину.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов, пока темно-синий цвет не разовьется до оптической плотности более единицы. После этого используйте считыватель пластин для записи поглощения на 655 нанометрах. Затем перелейте по 10 микролитров свежей надосадочной жидкости из каждого образца в 96-луночную белую пластину с плоским дном.

С помощью автоматического инжектора добавьте по 50 микролитров раствора люциферазы в каждую лунку, и сразу же зарегистрируйте люминесценцию скважина за лункой. Затем проверьте тормозящий эффект потенциальных кандидатов и оцените специфичность TLR, как указано в текстовом протоколе. В данном исследовании активация NF-Kappa B AP1 была обнаружена с помощью колориметрического анализа SEAP, в котором активация TLR-4 с помощью ЛПС приводит к активации NF-Kappa B AP1 и производству SEAP.

Высвобождающийся SEAP преобразует субстрат, что приводит к изменению цвета, пропорциональному количеству SEAP, высвобождаемому при стимуляции. Это количественно измеряется путем измерения поглощения на уровне 655 нанометров. Далее, ЛПС-опосредованная активация IRF привела к экспрессии люциферазы, катализирующей субстрат для производства люминесценции.

Оптимальная концентрация ЛПС в размере 10 нанограммов на миллилитр определяется на основе этих дозовых реакций для скрининга ранее созданной библиотеки гибридов пептид-ГМФ. Исходя из этого, была выделена группа гибридов по их мощной способности ингибировать активацию, вызванную ЛПС, как для NF-Kappa B AP1, так и для IRF. Валидация этой ингибирующей активности показывает, что по мере увеличения концентрации ЛПС ингибирующие эффекты гибрида снижаются, как и ожидалось.

Затем проводится иммуноблоттинг для подтверждения ингибирующей активности. Показано, что свинцовый гибрид снижает фосфорилирование p65, ингибирует деградацию I-Kappa B альфа и задерживает фосфорилирование IRF3, подтверждая, что свинцовый гибрид, P12, способен ингибировать LPS-опосредующую передачу сигналов TLR-4. Дополнительные исследования показывают, что P12 также снижает TLR-2 и TLR-5-опосредованную передачу сигналов NF-Kappa B AP1, а также TLR-3-опосредованную активацию IRF, что позволяет предположить, что P12 обладает мощной ингибирующей активностью на нескольких путях TLR.

После этой процедуры необходимо провести другие мероприятия, такие как иммуноблоттинг и анализ цитотоксичности, чтобы подтвердить результаты скрининга и избежать ложноположительных результатов. После своего развития этот метод проложил путь для других исследователей в области наномедицины к изучению наноингибиторов в передаче сигналов толл-подобных рецепторов в качестве информативных терапевтических средств следующего поколения.