Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении и валидации взаимодействия гетеромерного белкового комплекса с ДНК в гетерологичной системе для проведения функциональных геномных исследований в стандартных лабораторных условиях. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области функциональной геномики, например, в рамках плановой геномики. Основным преимуществом этой методики является возможность обнаружения взаимодействий белков с ДНК, в которых участвует более одного белка или транскрипционного фактора.

Начните выполнение данной процедуры во второй половине дня, который будет обозначен как день первый. Создайте культуру объемом 5 milliliter в синтетической определенной или SD среде без урацила, используя свежий высев из чашки Петри. Инкубируйте культуру в течение ночи в шейкере при температуре 30 degree Celsius.

На следующий день во второй половине дня инокулируйте 10 мл среды YPDA 500 мкл ночной культуры и инкубируйте в течение ночи в шейкере при 30 °C. Рано утром следующего дня инокулируйте 100 мл среды YPDA 2 мл ночной культуры. Выращивайте эту свежую культуру при 30 °C до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 0,4–0,8.

Центрифугируйте при 1000 ×g и 21 °C в течение 5 минут. Удалите супернатант. Добавьте 10 milliliters стерильной воды и ресуспендируйте осадок с помощью вортекс-смешивателя.

Центрифугируйте при 1000 ×g и 21 °C в течение пяти минут. Удалите супернатант, добавьте 2 mL ТЕ с ацетатом лития и ресуспендируйте осадок с помощью вортекса. Центрифугируйте при 1000 ×g и 21 °C в течение пяти минут.

Удалите супернатант. Добавьте 4 milliliters буфера TE с ацетатом лития и 400 microliters ДНК спермы лосося, затем ресуспендируйте осадок, перемешивая содержимое пипеткой. Теперь клетки готовы к трансформации, как показано в следующем сегменте.

Ко-трансфекция клеток проводится в 96-луночном U-образном миксерном планшете. Сначала распределите по 20 µL компетентных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем добавьте в лунки по 150 ng каждой из двух плазмид и нормализующего контроля.

На данной схеме представлена общая схема расположения лунок на планшете для ко-трансформации клеток дрожжей целевым белком. Расположение лунок может быть изменено в зависимости от целей эксперимента и количества тестируемых участков или фрагментов ДНК. Добавьте по 100 µL TE литий-ацетата полиэтиленгликоля в каждую лунку и перемешайте, трижды пропипетировав содержимое.

Накройте планшет дышащей мембраной и инкубируйте при 30 °C в течение 20–30 минут. Проведите тепловой шок при 42 °C ровно 20 минут. После теплового шока центрифугируйте при 1000 ×g и 21 °C в течение 5 минут.

Используя многоканальный дозатор, удалите супернатант. Добавьте 110 microliters TE-буфера и перемешайте. Снова центрифугируйте в течение 5 минут.

Удалите по 100 µL супернатанта из каждой лунки. Погрузите пробойник в 100% ethanol, прокалите его на огне, подождите одну минуту до остывания игл пробойника, а затем с помощью стерильного пробойника ресуспендируйте осадок. Перенесите клетки на чашки с агаром SD без триптофана и лейцина.

Инкубируйте планшеты при 30 °C в течение двух дней. Во второй половине пятого дня извлеките планшеты с культурами из инкубатора. Наполните каждую лунку стерильного U-образного миксерного планшета на 96 лунок 50 µL TE. Предварительно смочите стерильный пробоотборник в TE, вырежьте колонии с селективного среды SD без триптофана и лейцина и ресуспендируйте их в лунках с TE.

Перенесите колонии на новые чашки с агаром SD без триптофана и лейцина для оптимального покрытия поверхности. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение 2 дней. Во второй половине дня 7-го дня извлеките чашки с агаром из инкубатора.

Заполните каждую лунку стерильного 96-луночного U-образного смесительного планшета 50 µL среды SD без триптофана и лейцина. Заполните каждую лунку стерильного 96-луночного глубокого блока 180 µL среды SD без триптофана и лейцина. Стерилизуйте пробойник, предварительно смочите его и среду, затем перенесите колонии с планшета в лунки, содержащие 50 µL среды.

Перенесите 20 µL дрожжей в 180 µL среды SD с выпадением триптофана и лейцина. Герметизируйте блок дышащей мембраной и инкубируйте при 30 °C с перемешиванием в течение 36 часов. Утром девятого дня перенесите 100 µL культуры в 500 µL среды YPDA в стерильный 96-луночный глубокий планшет.

Накройте воздухопроницаемой заглушкой и инкубируйте при 30 °C с перемешиванием при 200 rpm в течение трех-пяти часов. Через три-пять часов ресуспендируйте культуру и перенесите по 125 µL из каждой лунки в планшет для спектрофотометра. Измерьте оптическую плотность при 600 nm, чтобы убедиться, что она находится в диапазоне от 0,3 до 0,6.

Центрифугируйте оставшиеся клетки в блоке с глубокими лунками при 3000 ×g и 21 °C в течение 10 минут. Удалите супернатант путем переворачивания. Добавьте 200 µL буфера Z в каждую лунку и перемешайте на вортексе.

Центрифугируйте при 3000 G и 21 °C в течение пяти минут. Удалите супернатант путем переворачивания. Добавьте в каждую лунку 21 µL буфера Z и перемешайте на вортексе.

Накройте планшет герметизирующей фольгой, устойчивой к циклам замораживания-оттаивания. В вытяжном шкафу проведите 4 цикла замораживания-оттаивания, используя жидкий азот и водяную баню при 42 °C. Добавьте по 200 µL свежеприготовленного раствора Z-буфера с бета-меркаптоэтанолом и ONPG в каждую лунку.

Инкубируйте при 30 °C от 17 до 24 часов или до появления окраски. Утром 10-го дня убедитесь, что окраска развилась. Добавьте в каждую лунку 110 µL 1 M карбоната натрия, чтобы остановить реакцию.

Зафиксируйте время и перемешайте содержимое планшета на вортексе. Центрифугируйте при 3000 ×g и 21 °C в течение десяти минут. С помощью многоканального дозатора перенесите 125 µL супернатанта из каждой лунки в планшет для спектрофотометра.

Измерьте оптическую плотность при 420 нанометрах. Рассчитайте активность бета-галактозидазы в электронной таблице, как описано в текстовом протоколе. В данном исследовании промоторная область длиной 2600 пар оснований выше сайта начала транскрипции была разделена на шесть областей или фрагментов.

На данной фотографии представлен пример успешно выращенного позитивного планшета после пятого дня выполнения протокола. В этом репрезентативном результате фрагменты ДНК один и четыре демонстрируют положительное взаимодействие с комплексом белков A и B. При измерении активности бета-галактозидазы для фрагмента один наблюдается четырехкратная индукция активности репортерного гена.

Важно помнить, что данная процедура рекомендуется для получения информации о регионах ДНК только после подтверждения предполагаемого белок-белкового взаимодействия и не предназначена для определения сайтов-мишеней. После выполнения этой процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы могут быть проведены другие методы, такие как ChIP-анализ и Msar. Например, для идентификации сайтов-мишеней in vivo.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как тестировать и подтверждать роль мультимерных белковых комплексов, связывающихся с общим ДНК-мишенью.