Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Модифицированный дрожжевой одногибридный анализ, описанный здесь, является расширением классического дрожжевого одногибридного (Y1H) анализа для изучения и проверки гетеромерного белкового комплекса-ДНК-взаимодействия в гетерологичной системе для любого исследования функциональной геномики.

Общая цель этого эксперимента заключается в изучении и валидации взаимодействия гетеромерного белкового комплекса и ДНК в гетерологичной системе для любого функционального геномного исследования в обычных лабораторных условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функциональной геномики, такой как плановая геномика. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обнаруживает взаимодействия белковой ДНК с участием более чем одного белка или фактора транскрипции.

Начните эту процедуру во второй половине дня, который будет обозначен как первый день. Начните выращивать 5 миллилитров культуры в синтетической определенной или SD среде без урацила из только что прорезанной чашки Петри. Инкубируйте в течение ночи в шейкере с температурой 30 градусов Цельсия.

На следующий день во второй половине дня закиньте 10 миллилитров среды YPDA 500 микролитрами ночной культуры и инкубируйте в течение ночи в шейкере при температуре 30 градусов Цельсия. Рано утром следующего дня закиньте 100 миллилитров среды YPDA с 2 миллилитрами ночной культуры. Выращивайте эту свежую культуру при температуре 30 градусов по Цельсию до тех пор, пока оптическая плотность на уровне 600 нанометров, не достигнет от 0,4 до 0,8.

Центрифугируйте при температуре 1000 G и 21 градусе Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 10 миллилитров стерильной воды и восстановите гранулу путем вортексирования.

Центрифугируйте при температуре 1000 G и 21 градусе Цельсия в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 2 миллилитра ацетата лития TE и восстановите гранулу путем вортексирования. Центрифугируйте при температуре 1000 G и 21 градусе Цельсия в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 4 миллилитра ацетата лития TE плюс 400 микролитров ДНК спермы лосося и повторно суспендируйте гранулу пипетированием вверх и вниз. Теперь клетки готовы к трансформации, как показано в следующем сегменте.

Котрансформация ячеек осуществляется в 96-луночной U-образной смесительной пластине. Во-первых, распределите 20 микролитров компетентных клеток на лунку в 96-луночной пластине. Затем добавьте в лунки по 150 нанограмм в каждую из двух плазмид и нормализуйте контролем.

На этой схеме показана общая схема планшета, предназначенная для котрансформации дрожжевых клеток с белком, представляющим интерес. Набор планшетов может быть изменен в соответствии с потребностями эксперимента и количеством тестируемых участков ДНК или фрагментов. Добавьте 100 микролитров TE, ацетата лития, полиэтиленгликоля на лунку и трижды перемешайте с помощью пипетирования.

Накройте пластину дышащим уплотнением и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. Тепловой шок при температуре 42 градуса Цельсия ровно на 20 минут. После теплового удара центрифугируйте при температуре 1000 G и 21 градусе Цельсия в течение 5 минут.

Используйте многоканальную пипетку для удаления надосадочной жидкости. Добавьте 110 микролитров TE и перемешайте. Снова центрифугируйте в течение 5 минут.

Удалите по 100 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки. Погрузите перфоратор в 100% этанол, подожгите его, подождите одну минуту, пока штифты перфоратора остынут, а затем используйте стерильный перфоратор для повторного суспендирования гранулы. Перенесите ячейки на SD-триптофан и люцин на шнековые пластины.

Выдерживайте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух суток. Во второй половине пятого дня достаньте пластины шнека из инкубатора. Заполните каждую лунку стерильной 96-луночной смесительной пластины с U-образным дном 50 микролитрами TE. Предварительно намочите стерильный перфоратор в TE, пробейте колонии из SD-триптофана и люциновой пластины и повторно суспендируйте их в заполненной TE пластине.

Перенесите колонии на новые шнековые пластины SD с триптофаном и люцином для оптимального покрытия поверхности. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 2 суток. Во второй половине дня 7-го дня достаньте пластины шнека из инкубатора.

Заполните каждую лунку стерильной 96-луночной смесительной пластины U-образным дном 50 микролитрами SD-триптофана и люциновой среды. Заполните каждую лунку стерильного блока глубиной 96 лунок 180 микролитрами SD триптофана и люциновой среды. Простерилизуйте дырокол, предварительно смочите перфоратор и среду, а затем переложите колонии из пластины в лунки, каждая из которых содержит 50 микролитров среды.

Переведите 20 микролитров дрожжей в 180 микролитров SD триптофана и люцина в среду. Запечатайте блок дышащим уплотнителем и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 36 часов. Утром девятого дня перенесите 100 микролитров культуры в 500 микролитров среды YPDA в стерилизованный блок глубиной 96 лунок.

Накройте дышащим уплотнением и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия с перемешиванием при 200 об/мин в течение трех-пяти часов. Через три-пять часов повторно суспендируйте культуру и переложите по 125 микролитров из каждой лунки на пластину спектрофотометра. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах, чтобы убедиться, что она находится в диапазоне от 0,3 до 0,6.

Центрифугируйте оставшиеся ячейки в глубоком колодце при температуре 3000 G и 21 градусе Цельсия в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость, перевернув ее. Добавьте по 200 микролитров Z-буфера в каждую лунку и вортекс.

Центрифугируйте при 3000 G и 21 градусе Цельсия в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость, перевернув ее. Добавьте 21 микролитр Z-буфера в каждую лунку и вортекс.

Накройте пластину герметизирующей пленкой, устойчивой к циклам замерзания, оттаивания. В вытяжном шкафу выполните 4 цикла замораживания/размораживания с использованием жидкого азота и водяной бани при температуре 42 градуса Цельсия. Добавьте в каждую лунку по 200 микролитров свежеприготовленного раствора бета-меркаптоэтанола Z буфера ONPG.

Инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 17–24 часов или до тех пор, пока не разовьется цвет. Утром 10 дня проверьте, что цвет развился. Добавьте в каждую лунку по 110 микролитров одного молярного карбоната натрия, чтобы остановить реакцию.

Запишите время и закрутите пластину. Центрифугируйте при температуре 3000 G и 21 градусе Цельсия в течение десяти минут. С помощью многоканальной пипетки передайте 125 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки на пластину спектрофотометра.

Измерьте оптическую плотность на 420 нанометрах. Рассчитайте активность бета-галактозидазы в таблице, как описано в текстовом протоколе. В этом исследовании промоторная область из 2600 пар оснований, расположенных выше начала сайта начала транскрипции, была сегментирована на шесть областей или фрагментов.

Эта фотография является примером хорошо отросшей и позитивной пластины после пятого дня протокола. В этом репрезентативном результате фрагменты ДНК 1 и 4 демонстрируют положительное взаимодействие с комплексом белков А и В. При измерении активности бета-голактисидазы на первом фрагменте наблюдается четырехкратная индукция активности репортерного гена.

Важно помнить, что данная процедура рекомендуется для получения информации об участках ДНК только после подтверждения предполагаемого белкового взаимодействия и не предназначена для предоставления информации о целевых участках. Следуя этим процедурам, можно предварительно использовать другие методы, такие как анализ чипов и MSAR, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, определение целевых сайтов in vivo.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проверить и подтвердить роль мультимерных белковых комплексов, связывающихся с общей мишенью ДНК.