Оптимизированный метод LC-MS/MS для высокой пропускной способности анализа клинических образцов Ivacaftor, его основных метаболитов и Lumacaftor в биологических жидкостях больных муковисцидозом

Это протокол подготовки образца для анализа плазмы. Обратите внимание, что для обеспечения их целостности все образцы и стандарты должны храниться при температуре от двух до восьми градусов Цельсия во время сбора и обработки. После завершения обработки храните все образцы при температуре минус 20 градусов.

Для стандартного приготовления готовят два независимых исходных раствора каждого анилида, ивакафтора, метаболита М1, метаболита М6 и люмакафтора в метаноле в концентрации 100 мкг на миллилитр и 10 мкг на миллилитр. Обратите внимание, что срок годности составов истекает через 10 дней на столе. Для стандартов необходимо переложить 100 микролитров человеческой плазмы в 1,5-миллилитровые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки.

Продолжайте делать то же самое для всех остальных образцов. Затем добавьте внутренний стандарт в каждую трубку. Например, мы выбираем 0,01 микрограмма на миллилитр из подготовленной нормы.

Теперь в этой трубке содержится плазма, пропитанная внутренним стандартом. Так же поступит и со всеми остальными стандартами. Возьмите свои штандарты и поверните их вниз в течение нескольких секунд, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки.

Продолжайте делать это для всех ваших 40 стандартов. Для образцов пациента перенесите 100 микролитров из пробирки пациента в микроцентрифужную пробирку. Реальный образец пациента не подгоняется под внутренний стандарт.

Поверните образец пациента на несколько секунд, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки. Следующие шаги предназначены как для образцов, так и для стандартов. Добавьте 200 микролитров 0,1%-ной муравьиной кислоты в ацетонитриле в каждую пробирку для осаждения белков плазмы.

Продолжайте делать это для всех стандартов и проб пациентов. Энергично обрабатывайте каждый образец в течение примерно 15 секунд. Продолжайте делать это для всех стандартов и взятых образцов.

Дайте постоять 10 минут в холодильнике, чтобы облегчить выпадение осадков. Для демонстрации я буду центрифугировать только один образец и один стандарт. Мы центрифугируем при 10 000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге Eppendorf 5430 при четырех градусах.

Теперь мы отфильтруем надосадочную жидкость во флаконах Phenomenex. Для этого мы используем 13-миллиметровый шприцевой фильтр с нейлоновыми фильтрами Grace толщиной 0,45 микрометра, купленными в США, и фильтруем во флаконы ВЭЖХ, которые могут содержать 1,5 миллилитров. После фильтрации мы переложим 100 микролитров надосадочной жидкости во флаконы ЖХ/МС для анализа ЖХ/МС.

Теперь этот образец готов к анализу. Теперь просто положите все образцы в штатив для флаконов. Мы используем систему Shimadzu 8030 LC/MS в сочетании с тройным квадрупольным масс-спектром.

Дайте системе уравновеситься перед анализом. После уравновешивания, которое занимает около 15 минут, просто нажмите кнопку «Пуск». Для каждого метаболита постройте калибровочную кривую, построив график соотношения пиковых площадей анилидов с номинальной концентрацией калибровочных стандартов.

Используйте уравнение регрессии для калибровочной кривой, чтобы рассчитать концентрации анилидов в полученном образце. Типичная хроматограмма показана на этом рисунке. Оптимизированное хроматографическое разрешение было получено с использованием подвижной фазы 100% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты в воде с градиентным элюированием на колонке Phenomenex Kinetex C8.

Время удержания ЖК было следующим. Для M6 — одна минута. Для М1 — 1,3 минуты.

Для ивакафтора 1,55 минуты. Для лумакафтора 2,3 минуты. Во всех образцах холостой плазмы не наблюдалось интерференции во время удержания любого из анилидов, а также не было обнаружено интерференции от комбинации ивакафтора с люмакафтором.

Проведя высокопроизводительный анализ большого количества образцов пациентов, мы оптимизировали наш метод за счет использования колонки обратной фазы хроматографии меньшего размера Phenomenex C8 и градиентной системы растворителей вместо текущей изократической элюции. Это сокращает время работы до шести минут на образец, включая фазу промывки. Этот надежный и новаторский метод предлагает простой, чувствительный и быстрый подход к терапевтическому мониторингу лекарственных препаратов ивакафтора и комбинации ивакафтора-люмакафтора и биологических жидкостей.

Учитывая необходимость разработки зависимостей «экспозиция-реакция» для максимизации эффективности лекарственного препарата, а также для сдерживания расходов на здравоохранение, необходимо разработать и валидировать более чувствительные инструменты, чтобы помочь клиницистам в использовании доказательной терапии и высокопроизводительных аналитических методов для пациентов, страдающих CF.By применяющих предложенный аналитический метод в клинических фармакокинетических и фармакодинамических исследованиях, возникает возможность дальнейшего изучения фармакокинетических параметров ивакафтора или Комбинация ивакафтора-люмакафтора на большом коллективе пациентов.