Профилирование IgG против Neu5Gc в человеческой сыворотке с помощью анализа сиалогликанового микрочипа
13 июля 2017 г.
Анализ с использованием сиалогликана для микрочипов может быть использован для оценки антител против Neu5Gc в сыворотке крови человека, что делает его потенциальным высокопроизводительным диагностическим анализом рака и других хронических заболеваний, опосредованных воспалением.
Общая цель анализа сиалогликанов микрочипов заключается в оценке Anti-Neu5Gc IgG в сыворотке крови человека высокопроизводительным способом в сравнении с разнообразной коллекцией сиалогликанов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гликоиммунологии, например, как антитела Anti-Neu5Gc связаны с различными заболеваниями человека, включая рак, болезни сердца и ксенотрансплантацию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить высокопроизводительное профилирование антител Anti-Neu5Gc против множества антигенов сиалогликанов.
Демонстрировать процедуру будет Шарон Иегуда, студентка магистратуры из моей лаборатории. Тщательное и подробное планирование изготовления и компоновки массивов важно для обеспечения успеха. Этот процесс подробно описан в текстовом протоколе и дополнительной информации.
Разбавьте каждый гликан до 100 микромоляров в общем объеме 100 микролитров печатного буфера гликана в микроцентрифужных пробирках. Далее готовят первичный амин, содержащий флуоресцентный краситель в дозе один миллиграмм на миллиметр с маркерным буфером. Затем разведите до одного микрограмма на миллилитр в одном миллилитре общего объема.
Приготовьте стандартные разведения IgG человека, как описано в текстовом протоколе. Поставьте пластину на 384 лунку на лед. Используя электронную мультипипетку, аликотируйте семь микролитров каждого гликана, маркера и звездообразной кривой IgG в соответствии с расположением планшетов, найденным в текстовом протоколе.
Накройте тарелку парапленкой и открутите в течение двух минут при температуре 250 раз g и 12 градусах Цельсия. Печать должна осуществляться в защищенном от пыли месте с влажностью от 60 до 70% Здесь все этапы проводятся в чистом помещении с соответствующими перчатками и одеждой для защиты. Включите нанопринтер и увлажнитель воздуха.
После программирования печатной машины, как описано в текстовом протоколе, поместите пластину 384 лунки с аликвотированными образцами на ее место на палубе массива и снимите крышку парапленки. На этом этапе начните печать. Пронумеруйте слайды маркером, устойчивым к спиртовым растворителям, и храните их в вакуумной коробке в темноте.
Чтобы обработать массивы, сначала снимите предметное стекло с вакуумной коробки и поместите его в химический колпак на пять минут массивом вверх, чтобы испарить лишнюю жидкость. Затем увлажните предметное стекло, поместив его в окрашивающую трубку, наполненную деионизированной водой. Накройте трубку пленкой и выдерживайте в течение пяти минут с медленным и аккуратным встряхиванием при комнатной температуре.
Чтобы заблокировать реактивные эпоксидные группы на предметном стекле, опустите предметное стекло в 50-миллилитровую красительную трубку, заполненную предварительно подогретым раствором для блокировки этаноламина. Накройте трубку пленкой и выдерживайте в течение 30 минут, медленно и осторожно встряхивая при комнатной температуре. Выбросьте раствор, блокирующий этаноламин, в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов.
Затем поместите предметное стекло в новую чистую красительную трубку, наполненную деионизированной водой с температурой 50 градусов Цельсия. Накройте трубку фольгой и выдерживайте в течение 10 минут, медленно и осторожно встряхивая при комнатной температуре. Слейте воду и переложите предметные стекла в держатель для стеклянных витражей.
Поместите аппарат в держатель качающейся пластины и высушите слайд на центрифуге. Затем поместите предметное стекло на 16-луночный разделитель. После предварительного смачивания лунок с помощью мультипипетки нанесите 200 микролитров PBST в лунки для предметных колец.
Затем поместите их в закрытую влажную камеру и встряхивайте в течение пяти минут. Извлеките PBST, слегка постучав по чистому бумажному полотенцу. Затем в каждую лунку внесите по 200 микролитров PBS-овальбумина в блокирующий буфер
.Поместите предметные стекла во влажную камеру и выдерживайте в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Далее подготовьте первичное детектирование, разбавленное в блокирующем буфере PBS-OVA, как описано в текстовом протоколе. Снимите блокирующий буфер PBS-OVA со стекла и добавьте 200 микролитров первичного антитела на лунку.
Выдержите предметные стекла во влажной камере в течение двух часов. Затем снимите основной датчик с предметного стекла и трижды промойте PBST. Выдержите предметное стекло в PBST в течение пяти минут во влажной камере, прежде чем промыть его в последний раз PBST.
Затем вымойте один раз с PBS. Далее приготовьте вторичное антитело в PBS, как описано в текстовом протоколе. Снимите PBS со стекла и добавьте 200 микролитров вторичного антитела.
Стряхните вторичное антитело со предметного стекла и четыре раза промойте PBST, как и раньше. Осторожно снимите рамку, затем поместите предметные стекла в 50-миллилитровую трубку для окрашивания предметных стекол, наполненную PBS, и встряхивайте в течение пяти минут. Далее наполните две ванночки для окрашивания горок деионизированной водой.
Поместите горку в держатель горки и опустите горку в первую ванну. Быстро опустите предметное стекло десять раз. Затем перенесите горку во вторую ванну и опустите еще десять раз.
После погружения выдержать горку в течение десяти минут при комнатной температуре с встряхиванием. После инкубации слейте воду и переложите предметное стекло в держатель для стеклянных витражей. Поместите держатель для окрашивания стекла в держатель с качающейся пластиной и высушите предметное стекло центрифугой.
Откройте дверцу сканера и поместите слайд внутрь массивом вниз. На этом этапе начните сканирование. Сохраните отсканированные слайды в формате TIFF.
Чтобы подготовить слайд к анализу, выберите «Загрузить список массивов» и загрузите соответствующий файл GAL, который отображает массивы в каждом блоке на слайде. Слайды были разработаны с использованием 16 различных групп первичного обнаружения, по одному в каждом блоке. Растительный лектин SNA связывает a2-6 связанную сиаловую кислоту.
В свою очередь, растительный лектин MALII связывает a2-3 связанную сиаловую кислоту. Поликлональный Anti-Neu5Gc IgY связывается с Neu5Gc-содержащими сиалогликанами, но не связывается с Neu5Ac-содержащими сиалогликанами. Для профилирования Anti-Neu5Gc IgG 12 сывороток от здоровых доноров были проанализированы на печатном сиалогликановом микрочипе и разработаны с использованием флуоресцентно меченного античеловеческого IgG в нормализованном до нанограммов на микролитр.
Все испытуемые сыворотки крови человека содержали различные уровни Anti-Neu5Gc IgG с почти полным отсутствием распознавания соответствующих пар Neu5Ac-содержащих сиалогликанов. Кроме того, паттерны распознавания Anti-Neu5Gc IgG сильно различаются между этими 12 различными сыворотками, как по уровню интенсивности, так и по разнообразию. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как профилировать антитела Anti-Neu5Gc в различных образцах человека с высокой пропускной способностью, используя систему гликановых микрочипов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод анализа с помощью микрочипа с сиалогликанами позволяет оценивать содержание антител IgG к Neu5Gc в сыворотке крови человека, обеспечивая высокопроизводительный анализ взаимодействия с различными сиалогликанами. Данный метод имеет важное значение для понимания роли антител к Neu5Gc в развитии таких заболеваний, как рак и хроническое воспаление.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гликоиммунология
- Хроническое воспаление
- Диагностика рака
Теоретическая часть
- Антитела к Neu5Gc вовлечены в развитие ряда заболеваний у человека.
- Понимание их роли может помочь в разработке диагностических инструментов.
- Данный анализ позволяет проводить профилирование с использованием разнообразной коллекции сиалогликанов.
- Высокопроизводительные методы необходимы для проведения крупномасштабных исследований.
Цель исследования
- Оценить уровень антител к Neu5Gc в сыворотке крови человека.
- Изучить их роль при различных заболеваниях.
- Разработать высокопроизводительный диагностический анализ.
Используемые методы
- Анализ с использованием микрочипа сиалогликанов
- Высокопроизводительный профилинг
- Изготовление микрочипа и планирование схемы расположения
- Предоставлены подробный протокол и дополнительная информация
Основные результаты
- Успешная оценка Anti-Neu5Gc IgG в сыворотке крови человека.
- Демонстрация эффективности анализа при профилировании антител.
- Понимание взаимосвязи между антителами и заболеваниями.
- Потенциал применения в диагностике рака и исследованиях хронического воспаления.
Выводы
- Анализ с помощью сиалогликанового микрочипа является перспективным диагностическим инструментом.
- Он расширяет понимание гликоиммунологии в контексте заболеваний.
- Будущие применения могут улучшить диагностику пациентов и стратегии лечения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Профилирование анти-Neu5Gc IgG в сыворотке крови человека позволяет снизить механистические риски при выборе гликоиммунологических мишеней при раке и хроническом воспалении. Высокопроизводительный анализ на сиалогликановых микрочипах предоставляет количественные и воспроизводимые данные для поддержки процессов валидации мишеней и разработки методов анализа. Данный подход повышает прогностическую достоверность установления связи между воздействием пищевых антигенов и иммунными ответами, имеющими значение для заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы о роли антител к Neu5Gc при раке и воспалении.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем измерения специфичности антител к гликанам, содержащим Neu5Gc.
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет анализа профилей сыворотки различных здоровых доноров.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа с использованием ковалентно связанных сиалогликанов на предметных стеклах с эпоксидным покрытием.
- Практическая ценность: обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемой печати 56 предметных стекол в 16-луночном формате.
- Научная ценность: возможность надежной оценки соединений путем скрининга 16 различных образцов сыворотки крови человека на одном предметном стекле для анализа интенсивности и разнообразия антител.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждается значимость для патологии посредством установления связи между антителами к Neu5Gc и карциномами, а также заболеваниями, опосредованными хроническим воспалением.
- Практическая ценность: Описывается последовательность этапов от обнаружения до доклинической валидации с использованием образцов сыворотки крови человека.
- Научная ценность: Основное внимание уделяется прогностическому снижению рисков путем выявления различных паттернов распознавания в разных образцах сыворотки.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод способствует развитию открывательной биологии посредством проверки гипотез и уточнения путей взаимодействия в гликоиммунологии.
- Открытия в биологии: Объясняет, как метод способствует проверке гипотез, уточнению путей передачи сигналов или снижению биологических рисков.
- Скрининг: Описывает готовность анализа, воспроизводимость или количественные результаты, если это предусмотрено статьей.
- Аналитика: Освещает измерения, показания или статистические данные, которые помогают командам сравнивать условия.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с доклинической преемственностью или согласованием биомаркеров только в тех случаях, когда это подтверждается источником.
- Корпоративное повторное использование: Представляет метод как многократно используемую возможность, а не как одноразовую технику.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишени, снижение механистической неопределенности.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о дальнейшем продвижении с учетом скорректированных рисков.
Рекомендации по внедрению
- Необходимые научные знания в области гликоиммунологии и работы с микрочипами.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая нанопринтер и сканер.
- Требования по межкомандной стандартизации изготовления и схемы расположения микрочипов.
- Особенности адаптации для различных модельных систем, таких как образцы сыворотки крови человека разного происхождения.
- Практические ограничения, обусловленные свойствами исходных материалов, включая необходимость работы в безпыльной среде с контролируемой влажностью.
