Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Общая цель данного метода заключается в обеспечении простой и эффективной процедуры негативного окрашивания вирусных образцов для просвечивающей электронной микроскопии (TEM) в условиях биологической изоляции. Этот метод позволяет ответить на ключевые вирусологические вопросы о морфологии и структуре исследуемых вирусов. Основным преимуществом данной техники является возможность простого и эффективного манипулирования сетками для электронной микроскопии в условиях биологического содержания. Этот метод полезен в рамках TEM-диагностики неизвестных вирусов, так как его можно легко применять к вирусным образцам в любых условиях. Хотя мы использовали этот метод преимущественно для проведения TEM-исследований вирусов, он имеет гораздо более широкое применение и может быть использован при ЭМ-исследовании большинства наночастиц. Как правило, лицам, впервые применяющим данный метод, может потребоваться некоторое время на освоение навыков, так как необходима практика, чтобы избежать повреждения TEM-сеток при их загрузке и выгрузке из капсул.

Идея этого метода впервые возникла у нас, когда мы столкнулись с трудностями при работе с небольшими сетками для ЭМ в условиях биологической изоляции.

Для начала данной процедуры подготовьте или приобретите медные сетки для ПЭМ с покрытием из Formvar и углерода. Поместите покрытые сетки для ПЭМ в капсулы. Затем перенесите заполненные капсулы вместе с другими расходными материалами и реагентами в зону биологической изоляции. Для начала прикрепите капсулу к пипетке. Аспирируйте 40 µL вирусной суспензии в капсулу. Положите пипетку на бок так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально, на 10 минут. Затем поднимите пипетку и слейте вирусный раствор в контейнер для отходов. Аспирируйте 40 µL 2% фиксатора глутаральдегида в капсулы. Положите пипетку на бок на 20 минут. После этого удалите фиксатор и аспирируйте 40 µL деионизированной воды в капсулу, чтобы вымыть фиксатор. Повторите эту промывку три раза.

Затем наберите в капсулу 40 µL либо 1% ацетата уранила, либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия. Выдержите капсулу в течение 30 секунд. Затем извлеките капсулу из пипетки.

Прикоснитесь кусочком фильтровальной бумаги к краю сеток, чтобы удалить излишки жидкости. Перенесите фильтровальную бумагу в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Затем вымочите фильтровальную бумагу в 1% растворе тетраоксида осмия.

Поместите капсулу с открытой крышкой в пробирку. Герметично закройте пробирку на один час для полного проникновения паров тетраоксида осмия. После этого проведите деконтаминацию пробирки и переместите ее из зоны биологической изоляции в помещение ЭМ с уровнем биобезопасности BSL-2.

Извлеките капсулу из центрифужной пробирки, затем поместите ее на наконечник пипетки. Вберите в капсулу 40 µL деионизированной воды, после чего слейте воду в контейнер для отходов. Повторите эту процедуру промывки водой три раза.

Затем извлеките капсулу из пипетки. Промокните сеточки фильтровальной бумагой досуха. Дайте сеточкам высохнуть на воздухе, после чего поместите их в контейнер для сеточек до начала ПЭМ-визуализации.

Для начала смешайте вирусную суспензию с равным объемом 4% глутаральдегида, чтобы получить конечную концентрацию глутаральдегида 2%. Используя фиксатор, инактивируйте вирус в течение не менее 24 часов. Продезинфицируйте пробирку и переместите ее в помещение для электронной микроскопии уровня биобезопасности BLS-2. После этого прикрепите захват с загруженной сеткой к пипетке. Аспирируйте смесь в капсулу. Положите пипетку на бок так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально, на 10 минут.

Затем возьмите пипетку и вылейте смесь вируса в контейнер для отходов. Наберите 40 µL деионизированной воды в капсулу, после чего слейте воду в контейнер для отходов. Повторите эту процедуру промывки три раза.

После этого в течение 30 секунд внесите в капсулу 40 µL либо 1% UA, либо 1% PTA. Извлеките капсулу из пипетки. Промокните сетки фильтровальной бумагой досуха.

Затем дайте сеткам высохнуть на воздухе.

В данном исследовании образцы вируса Эбола заирского штамма подвергаются негативному контрастированию с использованием как метода ручного нанесения капли, так и капсульного метода. ПЭМ-изображения, полученные обоими методами, демонстрируют четкие детали: структуры нуклеокапсида в центре вириона и видимые гликопротеины на поверхности. Таким образом, капсульный метод позволяет получать ПЭМ-изображения качества, сопоставимого с изображениями, полученными методом ручного нанесения капли. Далее на примере вируса Чикунгунья сравниваются различные способы инактивации образцов. Инактивация образцов осуществляется либо экспресс-методом с использованием 2% глутаральдегида в течение 20 минут с последующим воздействием 1% тетраоксида осмия в течение одного часа, либо в течение ночи с использованием 2% глутаральдегида в течение 24 часов. Как видно, более длительный процесс инактивации без использования тетраоксида осмия позволяет визуализировать большее количество ультраструктурных деталей.

Затем, с использованием метода капсул, было проведено сравнение двух красителей на вирусных частицах, фиксированных альдегидом. Как ацетат уранила, так и фосфорвольфрамовая кислота обеспечили высококачественные результаты с четко выраженными границами и видимыми гликопротеинами.

После освоения эта методика может быть выполнена примерно за полтора часа, в зависимости от количества образцов. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости выбора подходящего фиксатора и красителей в соответствии с целями вашего эксперимента. После завершения данной процедуры можно применить другие методы, такие как подсчет частиц, чтобы ответить на дополнительные вопросы путем расчета концентрации вируса.

Данный метод позволяет вирусологам с большей легкостью изучать морфологию и структуру вирусов, особенно при работе с вирусами уровней биобезопасности BSL-3 и BSL-4. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как легко манипулировать сетками для ПЭМ при проведении негативного окрашивания в условиях биологической изоляции. Не забывайте, что работа с альдегидом, тетраоксидом осмия и ацетатом уранила может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты и химического вытяжного шкафа.