Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить простую и эффективную процедуру негативного окрашивания ПЭМ вирусных образцов в биоизоляции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы вирусологии о морфологии и структуре исследуемых вирусов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простую и эффективную работу с сетками электронной микроскопии в условиях биоизоляции.

Этот метод используется в рамках ПЭМ-диагностики неизвестного вируса, поскольку его можно легко применять к образцам вируса в любых условиях. Хотя мы в основном использовали этот метод для помощи в исследованиях вирусных ПЭМ, он имеет гораздо более широкое применение и может быть использован в ЭМ-исследованиях большинства наночастиц. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется некоторая практика, чтобы убедиться, что сетки TEM не повреждаются при загрузке и выгрузке из капсул.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда у нас возникли проблемы с работой с небольшими электромагнитными решетками в биоизоляции. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте или приобретите из вирусной и углеродной формы медные сетки ПЭМ. Вставьте сетки ПЭМ с покрытием в капсулы.

Затем перенесите загруженные капсулы вместе с другими расходными материалами и реагентами в биосдерживание. Для начала прикрепите капсулу к пипетке. Аспирируйте 40 микролитров вируса расширения в капсулу.

Положите пипетку на бок так, чтобы решетки были ориентированы горизонтально, на 10 минут. Затем возьмите в руки пипетку и распределите раствор вируса в контейнер для отходов. Аспирируйте 40 микролитров 2% фиксатора глутаральдегида в капсулы.

Положите пипетку на бок на 20 минут. После этого изгоните фиксатор и аспирируйте 40 микролитров деионизированной воды в капсулу, чтобы смыть фиксатор. Повторите эту стирку три раза.

Затем внесите в капсулу 40 микролитров либо 1% уранилацетата, либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия. Оставьте капсулу на 30 секунд. Затем извлеките капсулу из пипетки.

Прикоснитесь листом фильтровальной бумаги к краю сетки, чтобы промокнуться. Переложите фильтровальную бумагу в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Далее замочите фильтровальную бумагу в 1%-ном растворе тетраоксида осмия.

Поместите капсулу с открытой крышкой в пробирку. Запечатайте трубку на один час, чтобы обеспечить полное проникновение паров тетраоксида осмия. После этого обеззаражьте пробирку и перенесите ее из биозащитной оболочки в установку BSL-2 EM.

Извлеките капсулу из пробирки центрифуги, затем поместите ее на пипетку. Отасуньте 40 микролитров деионизированной воды в капсулу, а затем раздайте воду в контейнер для отходов. Повторите эту промывку водой три раза.

Далее извлеките капсулу из пипетки. С помощью фильтровальной бумаги промокните насухо сетки. Дайте сеткам высохнуть на воздухе, а затем храните их в сетчатой коробке до тех пор, пока они не будут готовы к выполнению ПЭМ-визуализации.

Для начала смешайте суспензию вируса с равным объемом 4% глутарового альдегида, чтобы достичь конечной концентрации 2% глутарового альдегида. Используя фиксатор, инактивируйте вирус не менее чем на 24 часа. Обеззараживайте трубку и передайте ее в установку BLS-2 EM.

После этого прикрепите к пипетке захват с сеткой. Аспирируйте смесь в капсулу. Положите пипетку на бок так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально, на 10 минут.

Далее возьмите в руки пипетку и выбросьте вирусную смесь в контейнер для отходов. Отасуньте 40 микролитров деионизированной воды в капсулу, а затем выбросьте воду в контейнер для отходов. Повторите эту стирку три раза.

После этого вдохните 40 микролитров 1% QA или 1% PTA в капсулу в течение 30 секунд. Извлеките капсулу из пипетки. С помощью фильтровальной бумаги промокните насухо сетки.

Затем дайте решеткам высохнуть на воздухе. В этом исследовании образцы вируса Эбола в Заире подвергаются отрицательному окрашиванию с использованием как ручного капельного, так и капсульного метода. На изображениях ПЭМ, полученных с помощью этих методов, видны четко определенные детали, с нуклеокапсидными структурами в центре вариона и видимыми гликопротеинами на поверхности.

Таким образом, капсульный метод позволяет получать изображения ПЭМ аналогичного качества тем, которые получены ручным капельным методом. Далее сравниваются различные методы инактивации образцов с помощью вируса Чикунгунья. Инактивация образца достигается либо быстро, путем использования 2%-ного глутарового альдегида в течение 20 минут с последующим воздействием 1%-ного тетраоксида осмия в течение одного часа, либо в течение ночи, путем использования 2%-ного глутарового альдегида в течение 24 часов.

Как видно, более длительный процесс инактивации без тетраоксида осмия позволяет увидеть больше ультраструктурных деталей. Затем, используя капсульный метод, сравнивали два окрашивания с использованием альдегидных фиксированных вирусоподобных частиц. Как уранилацетат, так и фосфовольфрамовая кислота демонстрируют высокое качество результатов, с четко очерченными границами и видимыми гликопротеинами.

После освоения эта техника может быть выполнена примерно за полтора часа, в зависимости от количества образцов. Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить о выборе подходящих фиксирующих и окрашивающих реагентов для ваших экспериментальных целей. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как подсчет частиц, чтобы ответить на дополнительные вопросы путем вычисления концентраций вируса.

Этот метод позволяет вирусологам с легкостью изучать морфологию и структуру вируса, особенно в вирусах уровня BLS-3 и 4. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как легко обрабатывать сетки ПЭМ для негативного окрашивания в пределах биоизоляции. Не забывайте, что работа с альдегидом, тетраоксидом осмия и уранилацетатом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как надлежащие средства индивидуальной защиты и вытяжной шкаф для химикатов.