Выделение и характеристика основных крыса клапан интерстициальных клеток: Новая модель для изучения кальцификации клапана аорты

Общая цель этого протокола заключается в выделении интерстициальных клеток клапана крысы или ВИК для изучения механизмов кальцифицирующего заболевания аортального клапана. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кальцификации клапанов, например, почему VICs кальцифицируются и что мы можем сделать, чтобы предотвратить кальцификацию этих клеток. Основными преимуществами данной методики являются доступность и возможность трансформации в клеточные линии для дальнейших исследований.

Все вскрытия проводить в вентилируемом колпаке, предварительно продезинфицированном 70%-ным этанолом для обеспечения стерильности образцов и реагентов. Стерилизуйте инструменты для вскрытия путем их автоклавирования, а затем погрузите кончики инструментов в стакан, содержащий 70% этанола, перед использованием. Замочите инструменты для вскрытия в стаканах из буфера для мытья перед контактом с животным или тканями.

После выбраковки крыс, как описано в текстовом протоколе, поместите животное лежа на стеклянную доску для вскрытия и продезинфицируйте кожу, распыляя 70% этанол. Чтобы вскрыть сердце, сделайте четырехсантиметровый разрез по средней линии крысы с помощью ножниц для вскрытия, чтобы обнажить брюшную полость, и осторожно удалите грудную клетку и легкие, чтобы обнажить сердце. Удалите сердечко острыми ножницами.

Храните вскрытое сердце в ледяном буфере для промывки до тех пор, пока не будут завершены все грубые вскрытия крыс. Чтобы препарировать каждое сердце, перенесите рассеченное сердце в чашку Петри, покрытую буфером для промывки. Обрежьте сердечную мышцу парой пружинных прямых ножниц слева с небольшой областью, окружающей восходящую аорту и корень аорты.

С помощью тех же пружинных прямых ножниц осторожно разрежьте восходящую аорту по направлению к левому желудочку и обнажите створки аортального клапана. Затем переложите открытую аорту в свежую стерильную чашку Петри, наполненную сбалансированным солевым раствором Хэнка. Рассеките створки аортального клапана, отмеченные уникальной U-образной формой у основания аорты, с помощью ножниц Vannas.

Храните все листки-вкладыши в одном миллилитре ледяного буфера для стирки в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл до тех пор, пока не будут завершены все вскрытия. После того, как все листочки будут собраны, центрифугируйте их при 100 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить буфер для промывки. Чтобы удалить эндотелиальные клетки клапана или VECs, расщепите створки в 100 микролитрах 425 единиц на миллилитр коллагеназы II в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.

Нарушьте пищеварение, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Центрифугируйте при 100г в течение 30 секунд, чтобы гранулировать листочки. Тщательно выбросив надосадочную жидкость, промойте листочки 500 микролитрами буфера для промывки и повторно гранулируйте клетки центрифугированием при 100 г в течение 30 секунд.

Чтобы собрать ВИК из листочков, расварите со 100 микролитрами коллагеназы II в течение 1,5-двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем освободите VIC, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника для дозатора объемом 200 микролитров. Разведите коллагеназу II в 19 миллилитрах питательной среды и центрифугируйте при 670 г в течение пяти минут, чтобы измельчить ВИК и оставшийся мусор створки клапана.

После удаления надосадочной жидкости перенесите листки и ВИЦ в культуральные планшеты или колбы. Культивируйте ВМЦ в течение пяти-семи дней в питательной среде до тех пор, пока не будет достигнута конфлюенция при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO2, меняя среду через 72 часа. Чтобы подготовить первичные ВИК крыс для экспериментов по кальцификации in vitro, засейте клетки с плотностью 150 000 клеток на лунку в шестилуночных планшетах.

Поддерживайте клетки в культуральной среде до тех пор, пока конфлюенция не превысит 90%. Обработайте ВИК кальцификацией в сравнении с контрольной средой и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии 5% CO2 в течение еще 72 часов. Для изучения кальцинированных первичных ВИК крыс для последующих анализов удалите кальцификационную или контрольную среду.

Промойте монослои промывочным буфером для удаления несвязанных ионов кальция и фосфата перед выполнением определения характеристик VIC крыс, как подробно описано в текстовом протоколе. Для исследований кальциноза ВИК крысы окрашивают монослои клеток 5% раствором Ализарина Ред С, осторожно покачивая на шейкере в течение 20 минут. Впоследствии каждый раз трижды промывайтесь дистиллированной водой по пять минут.

Чтобы количественно оценить отложение кальция, используйте набор для биохимического анализа кальция. Пиявка ионов кальция с помощью 0,6 молярной соляной кислоты в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием. Соберите надосадочную жидкость и измерьте концентрацию кальция с помощью набора для анализа кальция в соответствии с рекомендациями производителя.

Наконец, рассчитайте концентрацию кальция в виде доли от общего клеточного белка, как описано в текстовом протоколе. Фенотип выделенных клеток ВИК был подтвержден с помощью иммунофлуоресценции, зондирования маркеров ВИК, виментина и альфа-актина гладкой мускулатуры. Кроме того, с помощью ПЦР-анализа была подтверждена экспрессия регулятора роста ВИК, фактора роста тканей бета-1 и 2.

Также был проведен вестерн-блоттинг для подтверждения отрицательного результата ВИК крыс по маркеру эндотелиальных клеток CD 31, с использованием митральных ВЭК собак в качестве положительного контроля. ВИК крыс подвергались воздействию повышенных уровней кальция и фосфата, которые имитируют патологические состояния гиперкальциемии и гиперфосфатемии. Обработка ВИК кальциево-индуцированным кальциевым и фосфатным образованием, определяемая методом окрашивания Ализариновым красным для осаждения кальция и колориметрическим определением уровня кальция после выщелачивания соляной кислотой.

Обработка ВИК кальцием и фосфатом индуцировала значительное увеличение экспрессии мРНК остеогенных маркеров MSX2, ALPL и PHOSPHO1. После освоения этой техники ее можно сделать за один-два часа, исключая разложение на 18 створок клапана. При попытке выполнить эту процедуру важно обеспечить стерильность во время вскрытия и пищеварения.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как выделять первичные ВИК крыс и использовать их для исследования механизмов кальцификации ВИК. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия и микроскопический анализ, для изучения физиологии и поведения ВИК. После его разработки этот метод может проложить путь исследователям в области сердечно-сосудистых исследований к изучению механизмов классификации аортального клапана у человека с использованием модели крысы.