Простой ликвидации фон флуоресценции в формалин Исправлена человеческий мозг ткани для микроскопии иммунофлуоресценции

Распространенной проблемой при иммунофлуоресцентной микроскопии является наличие эндогенной фоновой флуоресценции, которая может влиять на сигнал. Во многих случаях эта автофлуоресценция может сделать ваши результаты неинтерпретируемыми. В этом протоколе мы продемонстрируем, как удалить автофлуоресценцию из образцов тканей мозга человека с помощью фотоотбеливания с помощью коммерческой светодиодной настольной лампы.

Основными преимуществами этого метода являются значительная экономия средств по сравнению с существующими методами без ущерба для эффективности, а также отсутствие введения в образец экзогенных соединений. Прежде чем начать, приготовьте исходные растворы из одноразового трис-буферного физиологического раствора, TBS и 10% азида натрия. На каждые три предметных стекла микроскопа стандартного размера, которые вы хотели бы обработать, вам понадобится одна чашка Петри размером 100 на 100 миллиметров в качестве предметной камеры.

Для каждой ползунковой камеры приготовьте 50 миллилитров 05%-ного азида в TBS, добавив 25 миллилитров 10%-ного азида натрия к 50 миллилитрам однократного TBS. Создайте каркас для поднятия ползунковой камеры таким образом, чтобы под ним могла поместиться головка лампы. Для 100-миллиметровой квадратной чашки Петри можно вырезать пластиковый контейнер для пищевых продуктов аналогичного размера.

Можно использовать все, что может надежно поднять затворную камеру, не препятствуя попаданию света к образцам. Приобретите светодиодную настольную лампу с белым люминофором и снимите все диффузоры или непрозрачный пластик, закрывающие источник света. Ориентируйте светодиодную матрицу вверх.

Для этой цели рекомендуется использовать лампу с гибкой горловиной. Соорудите отражающую купольную крышку для аппарата, осветив внутреннюю часть коробки достаточно большой, чтобы покрыть слайд-камеры и леса алюминиевой фольгой. Для одной камеры можно использовать коробку с наконечником для пипетки диаметром в один миллиметр.

Для этого видео фиксированная формалином ткань головного мозга человека FTLD-T была подвергнута предварительной фотообесцвечивающей обработке. Процедуры подготовки тканей и окрашивания аминокислотами могут различаться в зависимости от источника, фиксации и встраивания участков ткани. В холодильной камере с температурой четыре градуса Цельсия, холодильном шкафу или холодильнике поместите лампу под строительные леса, а камеру для образцов — поверх лесов.

Заполните камеру для образца 50 миллилитрами азида TBS. Погрузите срезы тканей толщиной 10 микрометров, установленные на стандартные стеклянные предметные стекла микроскопа, в камеру для образцов с помощью чистых щипцов. Накройте аппарат отражающим куполом и включите светодиодную лампу.

Дайте образцам фотоотбеливаться в течение 48 часов. Это время инкубации может варьироваться в зависимости от интенсивности лампы и количества автофлуоресцентного материала в тканях. После предварительной обработки фотообесцвечивания предметные стекла могут быть иммуноокрашены по стандартному протоколу для вашей конкретной ткани и интересующих белков.

В демонстрационных целях ткань мозга FTLD-T окрашивали на фосфорилированный тау с использованием вторичных антител, конъюгированных с Alexa 488 и Texas Red. DAPI использовался в качестве противоядерного противовеса. Приготовьте 500 мл буфера для восстановления антигена, 500 мл 0,025% Triton X-100 в TBS, 10 мл 1%-ного бычьего сывороточного альбумина, BSA, в TBS и два миллилитра блокирующего раствора, состоящего из козьей сыворотки, добавленной к BSA TBS.

Выполните извлечение антигена, погрузив фотообесцвеченные предметные стекла в буфер для извлечения антигена в коллекторе предметных стекол. Нагрейте коллектор до 90 градусов Цельсия в течение 30 минут. После того, как коллектор был снят с термической обработки, важно дать камере остыть при комнатной температуре в течение 30 минут.

Немедленное снятие предметных стекол приведет к высыханию секций. Приготовьте основную смесь антител в соответствии с рекомендациями производителя. В этом случае антифосфо PHF tau p-serine 202 плюс антитело треонина 205 AT8 разводили один из 100 с BSA TBS и оставляли на льду.

На одну секцию требуется 150 микролитров смеси антител. После того как срезы остынут в течение 30 минут, перенесите предметные стекла из коллектора для извлечения антигена в баночку для окрашивания, наполненную TBS Triton. Промойте горки в этом растворе в течение пяти минут с легким встряхиванием.

Опорожните и замените TBS Triton, чтобы повторить этот шаг стирки во второй раз. После мытья снимите предметные стекла с банки для окрашивания и удалите излишки буфера. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте контур вокруг ткани.

Это предотвратит сход ваших решений с горки. Следите за тем, чтобы горки не высохли. Заблокируйте ткань, нанеся 200 микролитров блокирующего раствора на предметные стекла и поместите их внутрь увлажненной камеры.

Эта камера может быть чем-то простым, например, штативой, находящейся внутри коробки с наконечником для пипетки, содержащей мокрое бумажное полотенце. Убедитесь, что весь образец ткани покрыт блокирующим раствором. Выдерживать при комнатной температуре в течение двух часов.

Удалите заблокированный раствор с помощью аспиратора или пипетки. Нанесите пипеткой от 100 до 150 микролитров первичной смеси антител на предметные стекла. Убедитесь, что весь образец покрыт раствором антитела, а срезы находятся на ровной поверхности, чтобы избежать неравномерного скопления антител.

Инкубируйте с первичным антителом при четырех градусах Цельсия в течение ночи во влажной камере. На следующий день приготовьте вторичную смесь антител. В этом случае козий антимышиный Alexa 488 и козий антимышиный Texas Red были разведены один к 100 с помощью BSA TBS.

Извлеките срезы ткани и удалите первичный раствор антитела с помощью аспиратора или пипетки. Промойте предметные стекла два раза таким же образом, как и ранее, используя баночку для окрашивания, наполненную TBS Triton, в течение пяти минут для каждой стирки. После стирки удалите излишки буфера.

Пипеткой нанесите от 100 до 150 микролитров вторичного раствора антитела, еще раз убедившись, что образец ткани полностью покрыт. Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре во увлажненной камере в темноте. Приготовьте противоморочное пятно DAPI по 0,1 мкг на миллилитр в TBS согласно рекомендациям производителя или серийное разведение.

Обязательно тщательно перемешайте стоковый раствор DAPI из-за возможной нерастворимости. Достаньте предметные стекла и удалите вторичную смесь антител. Промойте образцы два раза, но вместо использования TBS Triton используйте обычный TBS.

Отсахарьте или напечатайте с пипетки оставшийся смываемый раствор и нанесите пипеткой 100–150 микролитров пятна DAPI на участки ткани. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Извлеките образцы и промойте их три раза обычным TBS вместо двух.

После стирки аккуратно удалите остатки раствора для стирки. Нанесите монтажный материал. Завершите монтаж предметного стекла, закрыв образцы стеклянными покровными крышками.

Избегайте появления пузырей, положив один край крышки слипом вниз и очень медленно опустив противоположный край с помощью щипцов. Дайте монтажному материалу высохнуть перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. Теперь слайды готовы к визуализации.

Настройки флуоресцентной микроскопии будут варьироваться в зависимости от флуорофоров, используемых для окрашивания, и микроскопа. Включите люминесцентную лампу, микроскоп и компьютер и дайте лампе нагреться в течение 15 минут. Поместите испачканные предметные стекла в флуоресцентный микроскоп.

Используйте светлое поле, чтобы расположить ткань при 10-кратном увеличении. Как только подходящий участок ткани будет найден, добавьте каплю воды поверх покровного стекла образца. Переключитесь на линзу с 20-кратным погружением в воду.

Выберите длины волн возбуждения и излучения лазера, подходящие для каждого флуорофора на отдельных дорожках для получения наилучшего сигнала. Более подробную информацию об используемых настройках и длинах волн можно найти в сопроводительной рукописи. Отрегулируйте мощность лазера и настройки усиления, чтобы оптимизировать интенсивность сигнала для каждой дорожки.

После того, как подходящие настройки и поле зрения найдены, сохраните составное изображение, содержащее данные флуоресценции с каждой дорожки. Для визуализации интенсивности флуоресценции в каждом канале установите макрос RGB Profile Tools для ImageJ. Откройте файл конфокального изображения lsm в программе ImageJ и преобразуйте составные изображения из трех стеков в RGB, перейдя в инструмент «Изображение, цвет, канал».

Выберите «Композитный» и отметьте все три канала. Далее, перейдите в Изображение, Тип и Цвет RGB. Выберите значок «Инструменты профиля RGB» и проведите линию через участок изображения, которое нужно профилировать.

В этом видео были описаны этапы выполнения предварительной обработки образцов тканей методом фотообесцвечивания для получения фоновой флуоресценции. Эта процедура может быть добавлена к любому стандартному протоколу аминофлуоресценции перед извлечением антигена и окрашиванием амино. Аппарат, используемый для фотоотбеливания, недорог и легко доступен, состоит из готовых компонентов.

Светодиоды с белым люминофором излучают свет в широком спектре длин волн, что делает их очень подходящими для фотообесцвечивания в широком диапазоне. С помощью легкодоступной светодиодной настольной лампы неокрашенные образцы ткани мозга человека с FTLD-T были фотообесцвечены и визуализированы с использованием длин волн, которые были бы подходящими, если бы эти образцы были окрашены Texas Red и Alexa 488. Необработанные образцы показали большое количество автофлуоресценции.

Напротив, фотообесцвечивание приводило к значительному снижению интенсивности автофлуоресцентных пятен, напоминающих липофусцин, а также общей фоновой флуоресценции. Для дальнейшей валидации этой методики образцы ткани мозга FTLD-T окрашивали на гиперфосфорилированный тау, белок, который неправильно сворачивается и накапливается при этом заболевании в виде отдельных тел включения. Два различных вторичных антитела были применены для лучшего различения мечения тау и неспецифической флуоресценции.

На этих составных изображениях колокализация Alexa 488 и Texas Red показана желтым цветом, что представляет правильно окрашенный тау-белок. Появление красных или зеленых участков свидетельствует либо о неспецифической флуоресценции, либо о гашении одного из хромофоров. В необработанном контрольном образце можно увидеть значительный фоновый и неспецифический сигнал, особенно в красном канале Техаса.

Как предварительная обработка фотоотбеливания, так и применение химического гасителя приводят к значительному снижению фонового сигнала. Если разделить флуоресцентные каналы и посмотреть на изображения при большем увеличении, можно сделать более детальные наблюдения. Необработанный контроль обладает фоновой флуоресценцией по всем каналам, а также неспецифическими особенностями, в основном в канале Texas Red, которые имеют интенсивность, аналогичную тау-специфической маркировке.

Если бы тау-тела включения не имели четкой, предсказуемой морфологии, эти результаты Texas Red могли быть неверно истолкованы из-за наличия этих автофлуоресцентных особенностей. Предварительная обработка фотообесцвечиванием полностью устраняет эти неспецифические особенности Texas Red, сохраняя при этом большинство специфических для тау-белка сигналов Texas Red и Alexa 488. Фотообесцвечивание, однако, по-видимому, оказывает незначительное влияние на фоновую флуоресценцию DAPI.

Химический гаситель снижает фоновую флуоресценцию в канале Alexa 488 так же эффективно, как и фотообесцвечивание. Тем не менее, он также снизил интенсивность флуоресценции как DAPI, так и Texas Red, что предполагает наличие некоторого контрпродуктивного гашения. Количественную оценку этих эффектов можно увидеть в профилях сигналов.

Как видите, этот метод позволяет получать чистые изображения, свободные от искажающих признаков. Эта предварительная обработка фотообесцвечиванием может быть включена в любой стандартный протокол аминофлуоресценции для удаления автофлуоресценции и получения высококачественных однозначных результатов.