Простой ликвидации фон флуоресценции в формалин Исправлена человеческий мозг ткани для микроскопии иммунофлуоресценции

Распространенной проблемой в иммунофлуоресцентной микроскопии является наличие эндогенной фоновой флуоресценции, которая может создавать помехи для вашего сигнала. Во многих случаях такая автофлуоресценция может сделать результаты интерпретации невозможными. В данном протоколе мы продемонстрируем способ удаления автофлуоресценции из образцов тканей головного мозга человека с помощью фотообесцвечивания с использованием коммерческой светодиодной настольной лампы.

Основными преимуществами данного метода являются значительная экономия средств по сравнению с существующими методами без потери эффективности, а также отсутствие введения экзогенных соединений в образец. Перед началом работы приготовьте стоковые растворы 1x трис-буферного солевого раствора (TBS) и 10% азида натрия. Для каждых трех стандартных предметных стекол, которые необходимо обработать, потребуется одна квадратная чашка Петри размером 100 мм на 100 мм в качестве камеры для стекол.

Для каждой камеры предметного стекла приготовьте 50 миллилитров 0,5% раствора азида в TBS, добавив 25 миллилитров 10% азида натрия к 50 миллилитрам 1× TBS. Создайте подставку, чтобы приподнять камеру предметного стекла так, чтобы под нее могла поместиться головка лампы. Для чашки Петри квадратного размера 100 миллиметров можно использовать пластиковый пищевой контейнер аналогичного размера, обрезав его по форме.

Для надежного подъема камеры со стеклом можно использовать любой предмет, который не препятствует прохождению света к образцам. Возьмите настольную лампу с белым фосфорным светодиодом (LED) и снимите все диффузоры или непрозрачный пластик, закрывающие источник света. Расположите светодиодный массив так, чтобы он был направлен вверх.

Для этой цели рекомендуется использовать лампу с гибким штативом. Изготовьте отражающий купольный кожух для аппарата, выложив внутреннюю часть коробки, размер которой достаточен для накрытия камер со стеклом и каркаса, алюминиевой фольгой. В случае использования одной камеры можно применить коробку от наконечников для микродозатора объемом 1 мл.

Для данного видео ткани орбитальной лобной извилины головного мозга человека с FTLD-T, фиксированные формалином, были подвергнуты предварительной обработке фотообесцвечиванием. Процедуры подготовки тканей и окрашивания аминогрупп могут варьироваться в зависимости от источника, способа фиксации и заливки ваших срезов ткани. В холодном помещении, холодильном шкафу или рефрижераторе при температуре 4 °C поместите лампу под штатив, а камеру с образцом — поверх штатива.

Заполните кювету для образца 50 миллилитрами TBS с азидом. С помощью чистых пинцетов погрузите срезы тканей толщиной 10 микрометр, закрепленные на стандартных стеклянных предметных стеклах, в кювету для образца. Накройте аппарат отражающим куполом и включите светодиодную лампу.

Оставьте образцы для фотовыгорания на 48 часов. Время инкубации может варьироваться в зависимости от интенсивности лампы и количества автофлуоресцентного материала в ткани. После предварительной обработки методом фотовыгорания препараты можно подвергнуть иммуноокрашиванию по стандартному протоколу для вашего конкретного типа ткани и интересующих белков.

Для демонстрационных целей ткани мозга при FTLD-T окрашивали на фосфорилированный тау-белок с использованием вторичных антител, конъюгированных с Alexa 488 и Texas Red. В качестве ядерного контрастного красителя использовали DAPI. Приготовьте 500 миллилитров буфера для восстановления антигена, 500 миллилитров 0,025% Triton X-100 в TBS, 10 миллилитров 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBS и два миллилитра блокирующего раствора, состоящего из сыворотки козы, добавленной к BSA TBS.

Проведите демаскировку антигенов, погрузив выбеленные предметные стекла в буфер для демаскировки антигенов в контейнере для стекол. Нагревайте контейнер при 90 °C в течение 30 минут. После извлечения контейнера из устройства для нагрева необходимо дать камере остыть при комнатной температуре в течение 30 минут.

Немедленное извлечение предметных стекол приведет к высыханию срезов. Приготовьте смесь первичных антител согласно рекомендациям производителя. В данном случае антитело anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 развели 1:100 в TBS с BSA и оставили на льду.

На один срез требуется 150 µL смеси антител. После того как срезы охладятся в течение 30 минут, перенесите стекла из контейнера для восстановления антигенов в стакан для окрашивания, заполненный TBS Triton. Промойте стекла в этом растворе в течение пяти минут при осторожном встряхивании.

Слейте и замените TBS Triton, чтобы повторить этот этап промывки второй раз. После промывки извлеките предметные стекла из стакана для окрашивания и удалите излишки буфера с помощью фильтровальной бумаги. С помощью гидрофобного маркера обведите контур ткани.

Это предотвратит растекание ваших растворов по предметному стеклу. Следите за тем, чтобы стекла не пересыхали. Заблокируйте ткань, пипетируя 200 µL блокирующего раствора на стекла, и поместите их в увлажненную камеру.

Эта камера может быть максимально простой, например, штативом для предметных стекол внутри коробки для наконечников дозатора с влажным бумажным полотенцем. Убедитесь, что весь образец ткани покрыт блокирующим раствором. Инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов.

Удалите блокирующий раствор с помощью аспиратора или пипетки. Нанесите пипеткой от 100 до 150 µL смеси первичных антител на предметные стекла. Убедитесь, что весь образец покрыт раствором антител и что срезы находятся на горизонтальной поверхности, чтобы избежать неравномерного скопления антител.

Инкубируйте с первичными антителами при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в увлажненной камере. На следующий день подготовьте смесь вторичных антител. В данном случае козьи антитела к мышиным Alexa 488 и козьи антитела к мышиным Texas Red развели 1:100 в BSA TBS.

Извлеките срезы тканей и удалите раствор первичных антител с помощью аспиратора или пипетки. Промойте предметные стекла два раза аналогичным образом, используя стакан для окрашивания, заполненный TBS Triton, по пять минут на каждую промывку. После промывки удалите излишки буфера фильтровальной бумагой.

Пипеткой нанесите от 100 до 150 µL раствора вторичного антитела, еще раз убедившись, что образец ткани полностью покрыт. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре в увлажненной камере в темноте. Приготовьте контрастную соль DAPI в концентрации 0.1 µg/mL в TBS в соответствии с рекомендациями производителя или методом серийного разведения.

Обязательно тщательно перемешайте стоковый раствор DAPI из-за возможной нерастворимости. Извлеките предметные стекла и удалите смесь вторичных антител. Промойте образцы дважды, используя обычный TBS вместо TBS Triton.

Откачайте или перенесите пипеткой остатки промывочного раствора, затем нанесите 100–150 µL красителя DAPI на срезы тканей. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Извлеките образцы и промойте трижды обычным раствором TBS вместо двух раз.

После промывки осторожно удалите остатки промывочного раствора. Нанесите среду для заключения. Завершите подготовку препарата, накрыв образцы покровными стеклами.

Чтобы избежать появления пузырьков воздуха, приложите один край покровного стекла к препарату и очень медленно опустите противоположный край с помощью пинцета. Дайте смоле для заключения высохнуть перед хранением при температуре четырех градусов Цельсия в темноте. Теперь предметные стекла готовы к визуализации.

Настройки флуоресцентной микроскопии будут различаться в зависимости от используемых для окрашивания флуорофоров и модели микроскопа. Включите флуоресцентную лампу, микроскоп и компьютер, и дайте лампе прогреться в течение 15 минут. Поместите предметные стекла с окрашенными тканями в флуоресцентный микроскоп.

Используйте светлое поле, чтобы найти ткань при 10-кратном увеличении. После обнаружения подходящего участка ткани нанесите каплю воды на покровное стекло образца. Переключитесь на объектив с погружением в воду с 20-кратным увеличением.

Выберите длину волны лазерного возбуждения и эмиссии, подходящую для каждого флуорофора в отдельных каналах, для обеспечения наилучшего сигнала. Более подробную информацию о настройках и используемых длинах волн можно найти в сопроводительной статье. Отрегулируйте мощность лазера и параметры усиления, чтобы оптимизировать интенсивность сигнала для каждого канала.

После выбора подходящих настроек и поля зрения сохраните композитное изображение, содержащее данные флуоресценции для каждого трека. Для визуализации интенсивности флуоресценции в каждом канале установите макрос RGB Profile Tools для ImageJ. Откройте файл конфикального изображения lsm в ImageJ и преобразуйте композитные изображения из трех стеков в RGB, перейдя в Image, Color, Channel Tool.

Выберите Composite и отметьте все три канала. Затем перейдите в Image, Type и RGB Color. Выберите значок RGB Profile Tools и проведите линию через область изображения, для которой необходимо создать профиль.

В данном видео описаны этапы предварительной обработки образцов тканей методом фотообесцвечивания для уменьшения фоновой флуоресценции. Эту процедуру можно добавить к любому стандартному протоколу иммунофлуоресцентного анализа перед стадиями восстановления антигенов и иммуноокрашивания. Установка, используемая для фотообесцвечивания, недорога, легкодоступна и состоит из серийных компонентов.

Белые фосфорные светодиоды (LED) излучают свет в широком спектре длин волн, что делает их крайне подходящими для широкополосного фотообесцвечивания. С помощью доступной светодиодной настольной лампы проводили фотообесцвечивание и визуализацию неокрашенных образцов тканей головного мозга человека с FTLD-T, используя длины волн, которые были бы соответствующими, если бы эти образцы были окрашены Texas Red и Alexa 488. Необработанные образцы демонстрировали высокий уровень автофлуоресценции.

Напротив, фотовыгорание привело к значительному снижению интенсивности автофлуоресцентных крапчатых структур, напоминающих липофусцин, а также общего фона флуоресценции. Для дальнейшей валидации данного метода образцы тканей головного мозга при FTLD-T были окрашены на гиперфосфорилированный tau — белок, который при данном заболевании подвергается неправильному сворачиванию и накапливается в виде отчетливых включений. Для более точного разграничения окрашивания tau и неспецифической флуоресценции применялись два различных вторичных антитела.

На этих комбинированных изображениях колокализация Alexa 488 и Texas Red показана желтым цветом, что соответствует правильно окрашенному тау-белку. Наличие красных или зеленых областей указывает либо на неспецифическую флуоресценцию, либо на тушение одного из хромофоров. В необработанном контрольном образце наблюдается значительный фоновый и неспецифический сигнал, особенно в канале Texas Red.

Как предварительная обработка методом фотообесцвечивания, так и применение химического гасителя приводят к значительному снижению фонового сигнала. Если разделить флуоресцентные каналы и рассмотреть изображения при большем увеличении, можно сделать более детальные наблюдения. Необработанный контроль обладает фоновой флуоресценцией во всех каналах, а также неспецифическими признаками, главным образом в канале Texas Red, интенсивность которых сопоставима с интенсивностью специфического мечения tau.

Если бы тельца включений тау-белка не имели четкой, предсказуемой морфологии, результаты окрашивания Texas Red могли быть интерпретированы неверно из-за наличия этих аутофлуоресцентных структур. Предварительный фотообесцвечивающий процесс полностью устраняет эти неспецифические признаки Texas Red, сохраняя при этом большую часть специфических сигналов Texas Red и Alexa 488 для тау-белка. Однако фотообесцвечивание, по-видимому, мало влияет на фоновую флуоресценцию DAPI.

Химический гаситель снизил фоновую флуоресценцию в канале Alexa 488 так же эффективно, как и фотообесцвечивание. Однако он также снизил интенсивность флуоресценции как DAPI, так и Texas Red, что указывает на наличие определенного контрпродуктивного гашения. Количественная оценка этих эффектов представлена в профилях сигнала.

Как видно, данный метод позволяет получить четкие изображения без мешающих факторов. Эту предварительную обработку фотообесцвечиванием можно включить в любой стандартный протокол аминофлуоресценции для устранения автофлуоресценции и получения высококачественных и однозначных результатов.