Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы изложить основополагающий подход в детальной методологии для измерения генетической гетерогенности в целевом участке надежным и надежным способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области редактирования генов, такие как как анализ и измерение мутагенеза на месте. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это стандартизированная методология для направленной гомологии репарации или коррекции генов с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов.

Для начала протокола выращивают HTT11619 клеток в 25 миллилитрах заранее подготовленной среды для культивирования клеток HTT116 в колбе Т-175. Отсадите среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером Дульбекко или PBS, без кальция и магния, затем аспирируйте PBS. Далее добавьте трипсин по каплям в колбу Т-175, используя пятимиллилитровую пипетку.

Дайте ячейкам отсоединиться в инкубаторе. Постучите по колбе, чтобы выбить ячейки, а затем погасите ячейки восемью миллилитрами готовой среды по всей поверхности колбы. Затем несколько раз пипетируйте смесь вверх и вниз, чтобы разбить клеточные комки и перенести клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Перед тем, как вращать клетки, возьмите 10 микролитров из конической трубки объемом 15 миллилитров и соедините их с 10 микролитрами трипанового синего цвета, чтобы подсчитать клетки, затем оболочьте клетки. Перенесите 10 микролитров клеток, смешанных с трипановым синим, в гемоцитометр и пересчитайте четыре сетки по всему периметру. На каждую 10-сантиметровую пластину клеток, которые должны быть синхронизированы, добавьте пять миллилитров полной среды и шесть микромоляров афидиколина.

Затем переложите 100 микролитров повторно суспензионной клеточной гранулы на каждую сантиметровую пластину и аккуратно перемешайте пластину, чтобы перемешать. Инкубируйте планшеты, чтобы синхронизировать клетки на границе G1S. За четыре часа до нацеливания аспирируйте среду, промойте PBS.

Отсадите PBS и добавьте пять миллилитров готовой среды. Поместите тарелку обратно в инкубатор на четыре часа. Введите мутантную последовательность гена EGFP в онлайн-генератор Zane Labs и выберите направляющие последовательности CRISPR, которые связываются в непосредственной близости от целевого сайта.

Смешайте РНК в равных молярных концентрациях до 45 микромоляров. Добавьте 6,75 микролитров из 200 микромолярного запаса CR РНК и 6,75 микролитров 200 микромольного запаса индикаторной РНК в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте 16,50 микролитров буфера IDT, чтобы получить окончательный объем 30 микролитров.

Далее нагрейте смесь при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, в ПЦР-машине. Дайте образцам остыть до комнатной температуры. Для каждого образца разведите 2,22 микролитра CR РНК до комплекса трассерной РНК и 2,78 микролитра буфера IDT до конечного объема в пять микролитров.

Разведите 1,67 микролитра белка Cas9 из 60 микромолярного запаса в 3,33 микролитрах среды с низким содержанием сыворотки до конечного объема в пять микролитров. Смешайте пять микролитров белка Cas9 с пятью микролитрами сложной РНК. Отсадите среду, промойте пятью миллилитрами PBS.

Отсадите PBS и добавьте по одному миллилитру предварительно подогретого трипсина на каждую 10-сантиметровую пластину. Поставьте пластины в инкубатор. Затем постучите по 10-сантиметровой пластине, чтобы убедиться, что все ячейки выбиты, а затем закалите их четырьмя миллилитрами готовой среды, распределив ее по всей поверхности пластины.

Проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить клеточные комки и перенести клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Отложите 10 микролитров из 15-миллилитровой конической трубки и соедините ее с 10 микролитрами трипанового синего для подсчета клеток. Гранулируйте клетки путем вращения в течение пяти минут при 125 x G при комнатной температуре.

Отсадите среду и промойте пятью миллилитрами PBS. Обваляйте ячейки, выкручивая 125 x G в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите 100 микролитров клеточной суспензии на каждую электропорацию с четырехмиллиметровым зазором кюветы.

Добавьте 10 микролитров комплекса РНП на 100 микролитров клеток, при плотности 5 х 10 к пятой клетке. Добавьте два микромолярных ODN к каждому образцу. Далее отнесите стеллаж к электропорационной машине.

Слегка переведите каждый из образцов и поместите их в камеру. Поместите штатив обратно в колпак и переложите каждый образец в лунку, содержащую два миллилитра полной среды в планшете с шестью лунками. Инкубируйте планшет перед проверкой уровней коррекции.

Отсадите среду и промойте клетки двумя миллилитрами PBS. Замените PBS 500 микролитрами предварительно подогретого трипсина в каждую лунку из шести лунок. Поместите пластины в инкубатор.

Затем постучите по пластине, чтобы убедиться, что все ячейки смещены, а затем закалите одним миллилитром готовой среды, диспергировав ее по всей поверхности лунки. Пропустите ячейки в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и гранулу. После гранулирования клеток аспирируйте среду, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера FACS.

Электропорируют синхронизированные и высвобождающиеся HTT11619 клетки в концентрации от 5 х 10 до пятой клетки на 100 микролитров, с комплексом РНП при 100 пикомоль и 100 пикомолами 72 NTODN при 2,0 микромолярах. Перенесите клетки в шестилуночный планшет и дайте им восстановиться в течение 72 часов. Затем отсортируйте ячейки по отдельности на 96-луночные планшеты, используя фак-сортировщик с лазером 488 нанометров для EGFP плюс минус.

Из лунок, в которых есть рост, выделите клеточную гДНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения ДНК. Амплируйте области, окружающие целевую базу, с помощью ПЦР. Наконец, проведите анализ секвенирования ДНК образцов.

Через 72 ч после инкубации анализа проточной цитометрии подтвердить функциональную репарацию зеленого флуоресцентного белка. Наблюдалась постепенная реакция на дозу по мере увеличения скоординированных уровней РНП и 72NT. Реакция редактирования генов в отсутствие частицы RNP корригировала примерно 1% клеток-мишеней, когда в реакции редактирования генов с одним агентом использовалась в 10 раз более высокая концентрация олигонуклеотида 72NT.

Были отобраны 16 клонов положительных образцов EGFP, а генетическая целостность, окружающая целевой сайт, была проанализирована с помощью секвенатора ДНК. Все 16 EGFP-положительных клеток содержали предсказанный обмен нуклеотидов в целевом центре. 15 незеленых клональных изолятов были проанализированы на гетерогенность в целевом центре.

Примерно в половине образцов не наблюдалось обмена основаниями ДНК. Остальные исследованные клональные экспансии показали гетерогенную популяцию делеционных мутаций. Размер удаления варьировался от одного основания до 19 оснований.

CRISPR, Cas9 и одноцепочечные олигонуклеотидные молекулы донорской ДНК, работающие в тандеме, могут привести к точной репарации точечной мутации в гене EGFP, как показано в этой новой модели репарации точечных мутаций, молекулярного пути, в котором донорская ДНК получает доступ к репликационной матрице для репарации мутантного основания. Этот процесс мы назвали ExACT. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области редактирования генов к изучению степени гетерогенности в целевом участке в результате активности редактирования генов в клеточных линиях.