Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

Общая цель этого итеративного рабочего процесса, сочетающего экспериментальный дизайн на основе Крингинга и технологию микробиореактора для обеспечения достаточной производительности культивирования, заключается в описании общего подхода к индивидуальному проектированию микробных сред для культивирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки микробных биопроцессов, таких как оптимизация питательных сред, условий биопроцессов, а также фенотипирование штаммов. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы спросили себя, подходят ли для производства гетерологичного белка питательные среды, оптимизированные для производства малых метаболитов.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он ускоряет общее время разработки за счет разумного сочетания эксперимента и моделирования. Демонстрировать эту процедуру будет Роман Янсен, аспирант из моей лаборатории. Начните эту процедуру с изучения концепции и определения методов, как подробно описано в текстовом протоколе.

Стерилизуйте глубоколуночные планшеты для хранения исходного раствора на рабочем столе, протерев пластины 70-процентным этанолом и затем высушив их в ламинарном вытяжном шкафу. Начните посев семян с инокуляции 50 миллилитров среды BHI, содержащей 25 мг на литр канамицина, одной аликвотой из рабочего банка клеток. Поместите всю необходимую лабораторную посуду на роботизированный рабочий стол и залейте исходные растворы в соответствующую лабораторную посуду.

Затем запустите роботизированный рабочий процесс по подготовке среды, чтобы последний этап, которым является инокуляция, был достигнут вовремя для начала посева семян. Возьмите образец семенной культуры примерно через два часа, чтобы контролировать рост, измеряя оптическую плотность на уровне 600 нанометров или O-D-600. Продолжайте следить за ростом каждый час.

Примерно через пять часов культура достигает O-D-600 от трех до четырех и используется для инокуляции основных культур. Поместите посев семян на рабочий стол обработчика жидкостей и продолжайте протокол подготовки среды. Запечатайте пластины микротитров культивации после инокуляции.

Далее поместите герметичный культиватор M-T-P в прибор Биолектор. Затем запустите предопределенный протокол выращивания. При необходимости утилизируйте оставшиеся исходные растворы в соответствии с правилами биобезопасности.

Затем высейте культуру с роботизированного рабочего стола. Очистите многоразовую лабораторную посуду перед началом протокола обеззараживания жидкостей. Остановите основной язык и региональные параметры по истечении 17 часов и обработайте данные, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы количественно определить титр G-F-P, сначала перенесите клеточные суспензии из всех культивационных лунок в предварительно обработанные реакционные пробирки. Затем центрифугируйте клеточные суспензии в течение 10 минут на максимальной скорости с помощью настольной центрифуги, чтобы получить бесклеточную надосадочную жидкость. Далее перелейте по 200 микролитров каждой свободной надосадочной жидкости в черную 96 лунку M-T-P с прозрачным дном.

Считывание удельной флуоресценции G-F-P на 488 нм для возбуждения и 520 нм для длины волны излучения с помощью соответствующего считывателя микропланшетов. После измерения флуоресценции G-F-P микропланшет можно непосредственно использовать для определения содержания белка в бесклеточной надосадочной жидкости с помощью стандартных протоколов, таких как анализ Брэдфорда или B-C-A. Наконец, перейдите к анализу данных, как описано в текстовом протоколе.

Продемонстрированная методика представляет собой один раунд экспериментов, результаты которого используются для построения последующих раундов с максимальным ожидаемым улучшением G-F-P сигнала. В каждом раунде размещаются эталонные эксперименты для анализа вариабельности данных и выявления экспериментальных выбросов. Этот контурный график дает общее представление о процедуре оптимизации.

Анализ собранного набора данных в ходе третьей итерации выявил ограничение положительного влияния магния, определив оптимальный диапазон концентраций. Поэтому было принято решение о дальнейшем расширении диапазона концентраций только для кальция в четвертой итерации. Процедуру повторяли дважды в пятой и шестой итерациях до тех пор, пока не было найдено насыщение сигнала G-F-P.

Такое насыщение объясняется выпадением соли кальция в осадок при применяемых концентрациях кальция, которые недоступны клетке. Седьмая итерация была использована для более детального изучения границ. Оптимальные диапазоны концентраций компонентов среды для насыщенного сигнала G-F-P могут быть надежно определены с помощью статистического Z-теста.

Он показывает идентифицированное плато, определенное и визуализированное с помощью набора инструментов Kringing. Набор инструментов Kringing находится в свободном доступе и поставляется с подробным руководством, в котором объясняется, как использовать его функции. Родовой характер представленного протокола позволяет проводить различные адаптации, такие как изучение других хозяев экспрессии микроорганизмов или оптимизация других свойств белка-мишени, таких как характер гликозилирования или дисульфидные связи.

Интеграция системы амбрионов увеличивает производительность экспериментов, что обеспечивает значительную экономию времени При замене полностью управляемых и управляемых биореакторов на амниарные системы необходимо учитывать масштабируемость результатов. Математическое моделирование и планирование экспериментов позволяет максимально повысить информативность данных измерений по отношению к изучаемой цели.