Регенерация выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в реальном времени ячейки

Общая цель этой процедуры заключается в регенерации коммерческих электронных пластин, оборудованных для анализатора клеток в реальном времени, или RTCA. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации одноразовых чипов на основе золота, в том числе регенерации электронных планов, используемых в RTCA. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процедуру регенерации можно проводить с использованием мягких и легкодоступных лабораторных реагентов с низкой токсичностью.

Впервые идея этого метода пришла к нам, когда мы начали использовать анализатор клеток в реальном времени, который стоил чипов на основе золота. Начните эту процедуру с инкубации и пролиферации клеток A549 в чашке для клеточных культур, как описано в текстовом протоколе. Добавьте по 150 микролитров клеточной среды в каждую инкубационную лунку электронной пластины L8. Оставьте тарелку на 30 минут в капюшоне для балансировки.

Через 30 минут вручную вставьте электронную пластину L8 в анализатор клеток в реальном времени в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Далее запустите на компьютере программу для работы Real-Time Cell Analyzer. На странице настройки шаблона эксперимента по умолчанию выберите Модель эксперимента и присвойте имя выполняющемуся анализу.

На странице макета выберите соответствующие лунки, которые будут включены в эксперимент, и введите такую информацию, как тип клеток, количество и названия лекарств, в поля редактирования. На странице расписания добавьте экспериментальные шаги, а затем выберите время выполнения каждого шага и интервал сбора данных в реальном времени. Нажмите «Пуск», чтобы измерить фоновое сопротивление носителя.

Файл эксперимента будет сохранен. Полученные данные будут автоматически вычтены. На странице графика добавьте скважины, и будет показан график индекса временной ячейки.

Для эксперимента по пролиферации клеток сначала нажмите кнопку паузы, чтобы приостановить программу. Затем выньте электронную пластину и добавьте 100 микролитров буфера для суспензии клеток A549 на лунку при комнатной температуре. Оставьте планшет на 30 минут в биозащитном колпаке, чтобы клетки осядли на дно инкубационных лунок.

Вручную вставьте электронную пластину в станцию анализатора сотовых систем реального времени. Затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы продолжить эксперимент. На странице графика анализатор непрерывно записывает значения индекса клеток, или кривые, на протяжении всего эксперимента.

Когда эксперимент будет завершен, перейдите на страницу графика и откройте файл эксперимента. Затем выберите все протестированные инкубационные лунки и полученные кривые клеточного индекса, которые могут быть усреднены или нормализованы в последний раз перед добавлением фармацевтических препаратов или сменой среды для уменьшения вариаций между анализами. На странице анализа данных можно рассчитать EC50 или IC50.

После проведения оценки цитотоксичности противоопухолевого препарата, как описано в текстовом протоколе, извлеките электронную пластину, содержащую клетки, со станции Real-Time Cell Analyzer. Поместите использованную электронную пластину в стерильный биозащитный колпак при комнатной температуре, и тщательно перемешайте питательную среду с помощью пипетки. Затем с помощью пипетки отсасывайте всю среду.

Промойте электронные пластины 200 микролитрами деионизированной воды в течение трех раз при комнатной температуре. Расщепите оставшиеся клетки на электронных планшетах с 0,25% свежеприготовленным трипсином в течение одного-двух часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Когда разложение будет завершено, работайте в биозащитном колпаке при комнатной температуре, чтобы перемешать инкубационный раствор от пяти до 10 раз с помощью пипетки, а затем удалить раствор.

Промойте электронные пластины 200 микролитрами деионизированной воды два раза. Затем постирайте 200 микролитрами 100% этанола два раза, а затем тем же объемом 75% этанола два раза. Наконец, промойте еще 200 микролитрами деионизированной воды два раза.

Переверните электронную пластину на стерильной марле или папиросной бумаге, чтобы сцедить оставшуюся воду комнатной температуры. Затем проведите ультрафиолетовую стерилизацию на регенерированной электронной пластине в течение одного-двух часов в биозащитном колпаке при комнатной температуре. После использования планшетов для доставки лекарства с использованием мезопористого материала, как описано в текстовом протоколе, расщепите оставшиеся клетки с трипсином, как и раньше.

Поскольку пипетка часто используется в экспериментах, человек должен быть внимателен, чтобы не поцарапать наконечник и поверхность микрочипов. Промойте микрочипы 200 микролитрами деионизированной воды один раз в биозащитном колпаке при комнатной температуре. Затем поднимите микросхемы с 200 микролитрами абсолютного этанола два раза при комнатной температуре.

Далее промойте микрочипы 200 микролитрами 75%-ного этанола один раз при комнатной температуре. Добавьте 250 микролитров 75%-ного этанола в каждую лунку и запечатайте электронную пластину с герметизирующей пленкой при комнатной температуре. После вращения электронной пластины со скоростью 114 G в течение двух минут опорожните пластину.

Переверните электронную пластину на стерильной марле или папиросной бумаге, чтобы сцедить оставшуюся жидкость комнатной температуры. Повторите полоскание с 75% этанолом, а затем отжим. Затем проведите ультрафиолетовую стерилизацию на регенерированной электронной пластине в течение одного-двух часов в биозащитном колпаке при комнатной температуре.

Оцените оптические характеристики регенерированной поверхности электронно-пластинчатой пластины, предварительно разобрав нижнюю часть инкубационного колодца, как описано в текстовом протоколе. Чтобы оценить жизнеспособность прикрепленных клеток после поглощения противоопухолевых препаратов на свежих и регенерированных электронных пластинах, используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для мониторинга спонтанной флуоресценции молекул DOX, поглощенных клетками A549. Чтобы зарегистрировать спонтанную флуоресценцию поглощенного DOX клетками, используйте 63-кратный масляный объектив и 485 нанометров в качестве длины волны возбуждения.

Затем оцените электрохимические свойства регенерированных электродов, сначала отполировав золотой электрод и стекловидный углеродный электрод до зеркальной поверхности с помощью иллюминатора на полировальной ткани. Затем обработайте электроды ультразвуком в воде, чтобы удалить любые частицы. Далее активируйте золотой электрод в 0,5-молярной серной кислоте.

Получите данные электрохимической импедансной спектроскопии (EIS) голого золотого электрода и стекловидного углеродного электрода в 10-миллимолярном растворе хлорида калия-электролита, содержащем один миллимолярный ферацианид калия. Теперь капните 10 микролитров клеточной суспензии на поверхность золотого электрода в GCE. После добавления элементов инкубируйте золотой электрод в GCE в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов до получения данных EIS модифицированных с помощью клеток электродов, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы регенерировать электроды, погрузите золотой электрод в GCE, модифицированный элементами в 0,25% трипсине, на 0,5-2 часа. Мягко промойте оба электрода водой четыре раза. Затем четыре раза мягко промойте электроды абсолютным этанолом.

Затем погрузите золотой электрод в GCE в 75% этанол примерно на пять минут. Через пять минут мягко промойте чип с 75% этанолом четыре раза, прежде чем получить данные ЭИС регенерированных электродов, как описано в текстовом протоколе. Для оценки эффективности регенерации массивной золотой электронной пластины были проведены микроскопические наблюдения как за свежими, так и за обработанными электронными пластинами.

Виртуальной разницы в оптических свойствах поверхности микрочипа обнаружено не было. Троесценция молекул доксорубицина используется для оценки клеточного статуса на золотых микрочипах до и после регенерации. Аналогичная гомогенность и четко определенная клеточная морфология продемонстрировали возможность повторного использования чипов.

Протокол регенерации применяется для реального испытания пролиферации клеток. Кривые роста, полученные из нескольких инкубационных лунок тестируемой электронной пластины, показывают хорошую консистенцию, что свидетельствует об успешной регенерации коммерческого чипа. На рисунке показано, как регенерированная электронная пластина L8 была протестирована для оценки цитотоксичности с использованием материалов с мезопористым кремнеземом.

Клеточный индекс образца, обработанного мезопористыми материалами, снизился по сравнению с контролем, что свидетельствует о незначительной цитотоксичности материалов. Дальнейшая инкапсуляция и высвобождение противоопухолевого препарата доксорубицина мезопористыми материалами приводили к резкому снижению кривой роста клеток А549. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что время разложения стока может отличаться от чипа к чипсу. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия или даже спектроскопия, электрохимическая импедансная спектроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как оценка эффекта регенерации.