Регенерация выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в реальном времени ячейки

Общая цель данной процедуры заключается в регенерации коммерческих электронных планшетов, предназначенных для анализатора клеток в реальном времени (Real-Time Cell Analyzer, RTCA). Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области регенерации одноразовых чипов на основе золота, включая регенерацию электронных планшетов, используемых в RTCA. Основным преимуществом данной методики является то, что процедура регенерации может быть проведена с использованием мягких и доступных лабораторных реагентов с низкой токсичностью.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы начали использовать анализатор клеток в реальном времени (Real-Time Cell Analyzer), который требует дорогостоящих чипов на основе золота. Начните выполнение данной процедуры с инкубации и пролиферации клеток A549 в чашке для культивирования клеток, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 150 µL культуральной среды в каждую инкубационную лунку электронного планшета L8. Оставьте планшет на 30 минут в боксе биологической безопасности для уравновешивания.

Через 30 минут вручную установите электронный планшет L8 в анализатор клеток в реальном времени (Real-Time Cell Analyzer) в CO2-инкубаторе при 37 °C. Затем запустите программу управления анализатором клеток в реальном времени на компьютере. На странице настроек шаблона эксперимента по умолчанию выберите модель эксперимента (Experiment Model) и присвойте имя проводимому анализу.

На странице разметки (layout page) выберите соответствующие лунки, включенные в эксперимент, и введите такую информацию, как тип клеток, их количество и названия препаратов, в поля редактирования. На странице расписания (schedule page) добавьте этапы эксперимента, затем выберите время выполнения каждого этапа и интервал сбора данных в режиме реального времени. Нажмите кнопку «Start» (Старт), чтобы измерить фоновый импеданс среды.

Файл эксперимента будет сохранен. Полученные данные будут вычтены автоматически. На странице построения графиков добавьте лунки, после чего будет отображен график зависимости индекса клеток от времени.

Для проведения эксперимента по пролиферации клеток сначала нажмите кнопку паузы, чтобы приостановить работу программы. Затем извлеките электронный планшет и при комнатной температуре добавьте в каждую лунку по 100 microliters буфера с суспензией клеток A549. Оставьте планшет на 30 минут в боксе биологической безопасности, чтобы клетки осели на дно инкубационных лунок.

Вручную установите электронный планшет в станцию анализатора клеток в режиме реального времени. Затем нажмите кнопку запуска для продолжения эксперимента. На странице графиков анализатор непрерывно регистрирует значения клеточного индекса (кривые) на протяжении всего эксперимента.

По завершении эксперимента перейдите на страницу графиков и откройте файл эксперимента. Затем выберите все исследуемые лунки с инкубацией и полученные кривые индекса клеток, которые можно усреднить или нормализовать в последний раз перед добавлением фармацевтических препаратов или сменой среды для уменьшения вариативности между анализами. На странице анализа данных можно рассчитать EC50 или IC50.

После проведения оценки цитотоксичности противоопухолевого препарата, согласно описанному в текстовом протоколе, извлеките электронный планшет с клетками из системы Real-Time Cell Analyzer. Поместите использованный электронный планшет в стерильный бокс биологической безопасности при комнатной температуре и тщательно перемешайте культуральную среду с помощью пипетки. Затем с помощью пипетки полностью аспирируйте среду.

Промойте электронные планшеты 200 µL деионизированной воды трижды при комнатной температуре. Проведите дигестию оставшихся клеток на электронных планшетах с использованием 0.25% свежеприготовленного трипсина в течение одного-двух часов в инкубаторе при 37 °C. По завершении дигестии в боксе биологической безопасности при комнатной температуре перемешайте инкубационный раствор с помощью пипетки от 5 до 10 раз, после чего удалите раствор.

Промойте электронные платы деионизированной водой по 200 µL дважды. Затем промойте 100% ethanol по 200 µL дважды, после чего дважды промойте тем же объемом 75%ethanol. В завершение дважды промойте еще по 200 µL деионизированной воды.

Переверните электронную пластину на стерильную марлю или бумажную салфетку, чтобы слить остатки воды при комнатной температуре. Затем проведите ультрафиолетовую стерилизацию регенерированной электронной пластины в течение одного-двух часов в боксе биологической безопасности при комнатной температуре. После использования пластин для доставки лекарственных средств с помощью мезопористого материала, как описано в текстовом протоколе, проведите трипсинизацию оставшихся клеток, как было указано ранее.

Поскольку пипетка часто используется в экспериментах, исследователь должен проявлять осторожность, чтобы не поцарапать наконечник и поверхность микрочипов. Один раз промойте микрочипы 200 µL деионизированной воды в шкафу биологической безопасности при комнатной температуре. Затем дважды промойте микрочипы 200 µL абсолютного этанола при комнатной температуре.

Затем один раз промойте микрочипы 200 µL 75% ethanol при комнатной температуре. Добавьте по 250 µL 75% ethanol в каждую лунку и загерметизируйте электронный планшет с помощью герметизирующей пленки при комнатной температуре. После центрифугирования электронного планшета с ускорением 114 ×g в течение двух минут опорожните планшет.

Переверните электронную пластину на стерильную марлю или бумажную салфетку, чтобы слить оставшуюся жидкость при комнатной температуре. Повторите промывку 75% ethanol с последующим центрифугированием. Затем проведите ультрафиолетовую стерилизацию регенерированной электронной пластины в течение одного-двух часов в боксе биологической безопасности при комнатной температуре.

Оцените оптические характеристики регенерированной поверхности электронного планшета, предварительно разобрав нижнюю часть инкубационной лунки, как описано в текстовом протоколе. Для оценки жизнеспособности прикрепленных клеток после поглощения противоопухолевого препарата на свежих и регенерированных электронных планшетах используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для мониторинга спонтанной флуоресценции молекул DOX, поглощенных клетками A549. Для регистрации спонтанной флуоресценции поглощенного клетками DOX используйте иммерсионный объектив с увеличением 63x и длину волны возбуждения 485 nanometers.

Затем оцените электрохимические свойства регенерированных электродов, предварительно отполировав золотой и стеклоуглеродный электроды до зеркального блеска с использованием суспензии illuminos на полировальной салфетке. После этого обработайте электроды в ультразвуковой ванне с водой для удаления частиц. Затем активируйте золотой электрод в 0.5-молярном растворе серной кислоты.

Получите данные электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС) для чистого золотого электрода и стеклоуглеродного электрода в 10 мМ растворе электролита хлорида калия, содержащем 1 мМ феррицианида калия. Затем нанесите 10 µL суспензии клеток на поверхность золотого электрода в GCE. После добавления клеток инкубируйте золотой электрод в GCE в инкубаторе при 37 °C в течение трех часов, после чего получите данные ЭИС для электродов, модифицированных клетками, как описано в текстовом протоколе.

Для регенерации электродов погрузите золотой электрод и модифицированный клетками стеклянный углеродный электрод (GCE) в 0.25% раствор трипсина на период от 0,5 до 2 часов. Осторожно промойте оба электрода водой четыре раза. Затем осторожно промойте электроды абсолютным этанолом четыре раза.

Затем погрузите золотой электрод в GCE в 75% ethanol примерно на пять минут. По истечении пяти минут осторожно промойте чип 75% ethanol четыре раза, после чего получите данные EIS для регенерированных электродов, как описано в текстовом протоколе. Для оценки эффективности регенерации массированной золотой электронной пластины было проведено микроскопическое исследование как новых, так и обработанных электронных пластин.

Виртуальных различий в оптических свойствах поверхности микрочипа обнаружено не было. Флуоресценция молекул доксорубицина используется для оценки состояния клеток на золотых микрочипах до и после регенерации. Сходная гомогенность и четко выраженная морфология клеток продемонстрировали возможность повторного использования чипов.

Протокол регенерации применяется для фактического теста пролиферации клеток. Кривые роста, полученные из нескольких лунок для инкубации исследуемого электронного планшета, демонстрируют хорошую согласованность, что указывает на успешную регенерацию коммерческого чипа. Здесь представлен регенерированный электронный планшет L8, который был протестирован для оценки цитотоксичности с использованием мезопористых материалов на основе диоксида кремния.

Индекс клеток образца, обработанного мезопористыми материалами, снизился по сравнению с контролем, что указывает на слабую цитотоксичность материалов. Дальнейшее инкапсулирование и высвобождение противоопухолевого препарата доксорубицина мезопористыми материалами привели к резкому снижению кривой роста клеток A549. После освоения эта методика может быть выполнена за четыре часа при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что время травления в приемном резервуаре может варьироваться от чипа к чипу. После завершения этой процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как оценка эффекта регенерации, могут быть применены другие методы, например, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, спектроскопия или электрохимическая импедансная спектроскопия.