Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Протокол описывает подробно поколения след бесплатный индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от человеческих клеток поджелудочной железы в фидер свободных условиях, вслед за этим редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ribonucleoproteins и характеристика изменение клоны одноклеточных.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или IPSC из клеток поджелудочной железы человека в условиях, свободных от фидеров, затем отредактировать клетки с помощью рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9 и, наконец, охарактеризовать модифицированные клоны одиночных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области редактирования генома стволовых клеток человека, такие как создание IPSC без следов и редактирование с помощью рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9. Основное преимущество этой методики заключается в том, что клональные линии отредактированных IPSC могут быть сгенерированы с высокой надежностью и отсутствуют признаки мозаицизма.

После покрытия шестилуночного планшета холодным коллагеном, планшет для раннего пассажа первичных клеток поджелудочной железы человека в среде Prigrow III на 2-й день для достижения примерно 2,5 x 10 на 5 клеток или не менее 60% конфлюенции на лунку в день трансдукции или в нулевой день. В день трансдукции после забора и подсчета клеток согласно текстовому протоколу разморозьте на льду один комплект векторных пробирок Сендай и аккуратно добавьте рассчитанные объемы каждой пробирки в 1 мл предварительно разогретой среды Prigrow III. Аккуратно пипеткой перемешать раствор.

Отсадите Prigrow III из клеток и медленно добавляйте в лунки перепрограммирующую вирусную смесь. Затем инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. Через двадцать четыре часа после трансдукции тщательно отбросьте вирусную смесь на клетках и замените ее свежей средой Prigrow III.

На шестой день добавьте в клетки 1 мл раствора для отслоения клеток и инкубируйте их в течение 10 минут. Затем, используя Prigrow III с ингибитором горных пород, нанесите все клетки на чашки с MEF, приготовленными накануне. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на ночь.

Регулярно наблюдайте за пластинами на предмет появления клеточных скоплений или колоний, указывающих на перепрограммированные клетки, которые образуют клональные агрегаты с булыжной морфологией и большим ядром и ядрышками. Отметьте вероятные колонии IPSC и регулярно проверяйте их на рост. Почти через четыре недели после трансдукции, после подготовки 24 луночных МЭФ-планшетов, подготовить матричную мембрану путем ее аликвотирования на основе коэффициента разведения, указанного в сертификате анализа.

Выберите 24-48 колоний и перенесите их на 24-луночные планшеты, покрытые матричной мембраной, с помощью mTeSR1. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов и меняйте среду каждый день. Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации.

Добавьте 500 мкл диспаза, чтобы отделить прочные колонии, нанесенные на мембрану матрицы. После инкубации клеток в течение 20 минут снова выложите их на матричную мембрану, покрытую 12 лунками планшетов. Расширить и охарактеризовать клоны с помощью окрашивания щелочной фосфатазой, иммуноокрашивания и анализа FACS в соответствии с текстовым протоколом.

Для трансфекции HIPSCs после синтеза SGRNA в соответствии с текстовым протоколом необходимо приготовить мастер-смесь nucleofaction для каждого образца путем объединения 0,5 мкг белка Cas9 и 0,5 мкг каждой SGRNA в реакционном объеме 22 мкл. После аспирации среды, содержащей ингибитор горных пород, используйте 2 мл RTPBS для промывки каждой лунки от ISPC. Затем аспирируйте PBS и добавьте 1 мл раствора для отслойки клеток.

Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Восстановите суспендию клеток в 3 мл среды mTeSR1 и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы получить суспензию одной клетки. Перенесите диссоциированные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл среды mTeSR1.

В мастер-смесь нуклеофекции добавьте 16,4 мкл добавки первичных клеток P3 и 3,6 мкл добавки 1 из набора Nucleofector. После подсчета и вращения клеток повторно суспендируйте каждую единицу 0,5 х 10 на 6-ю ячейку в 22 мкл предварительно приготовленной мастер-смеси для трансфекции. Быстро перенесите клетки в центральную камеру одной лунки с помощью нуклеокуветной полоски.

Затем поместите полоску в устройство Nucleofector и проведите нуклеофект клеток с помощью программы CB150. После нуклеофекции быстро добавьте 80 мкл предварительно нагретой среды mTeSR1, содержащей 10 микромолярных ингибиторов горных пород, в каждую лунку нуклеофectированных клеток. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.

Аккуратно переведите клетки из полоски в лунки матричной мембраны с предварительно покрытым покрытием 12-луночным планшетом, содержащим среду mTeSR1 с ингибитором породы. На второй день инкубации после подготовки MEF планшетов замените среду на HIPSC с mTeSR1 на mTeSR1 с добавлением 1XSMC4 не менее чем за два часа до сортировки одиночных клеток. Аспирируйте среду из HIPSC и используйте PBS для мягкой промывки клеток.

Затем добавьте 500 мкл раствора для отделения клеток в каждую лунку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Создайте суспензию для одной клетки, добавив 1 мл mTeSR1 в каждую лунку, и осторожно пипетируйте вверх и вниз несколько раз. Отсортируйте отдельные ячейки по отдельным лункам заранее подготовленной 96 луночной пластины.

Через четыре дня после сортировки должно быть заметно образование колоний. На этом этапе замените питательную среду средой HESC с добавлением 1X SMC4. После извлечения и расширения целевой ДНК в соответствии с текстовым протоколом с помощью набора анализатора фрагментов прогоните ПЦР-амплифицированную целевую область генома всех клонов через смесь гелевого красителя в соответствии с инструкциями производителя.

Подтвердите плюрипотентные клоны IPSC в соответствии с текстовым протоколом. До трансдукции вируса Сендай клетки поджелудочной железы демонстрировали типичную веретенообразную морфологию. Небольшие плотные колонии появляются на MEF к 12-му дню, напоминая человеческие колонии плюрипотентных клеток.

Как правило, полностью перепрограммированные человеческие колонии IPSC имеют очень четкие границы и могут быть обнаружены на 23-30 день. Здесь показана диссоциированная колония на 23-й день. Здесь представлено типичное фазово-контрастное изображение колонии IPSC после пикирования и культивирования в условиях отсутствия фидеров после перепрограммирования клеток поджелудочной железы вирусом Сендай

Колонии IPSC, окрашенные щелочной фосфатазой в красный цвет, находятся справа. IPSC были подтверждены иммуноокрашиванием на маркеры плюрипотентности OCT4 и NANOG, как видно на этих панелях. В этом эксперименте IPSC окрашивали маркерами клеточной поверхности, а анализ FACS проводили на суспензии одной клетки.

Зеленый пик представляет IPSC поджелудочной железы, а фиолетовый пик содержит IPSC-отрицательные клетки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании асептических или стерильных условий для сортировки клеток и культивирования клеток. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как нацеливание на гены в IPSC и ESC, а также получить ответы на дополнительные вопросы путем проведения точных генетических модификаций.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как надежно создавать IPSC без занимаемой площади и без фидеров и выполнять биаллельное редактирование генома.