Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы очистить и изолировать первичные эндотелиальные клетки головного мозга свиньи, чтобы создать жесткую модель гематоэнцефалического барьера in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематоэнцефалического барьера, такие как доставка лекарств, проницаемость, транспортировка рецепторов, а также плотность и полярность BB. Основным преимуществом данной модели является высокий выход первичных эндотелиальных клеток головного мозга, которые могут быть использованы для создания модели гематоэнцефалического барьера in vitro, обладающей высоким TEER и низкой проницаемостью. Чтобы начать эту процедуру, поместите мозги на стерильную скамейку и аккуратно промойте их одним литром PBS в стакане, положенном на лед.

Затем осторожно удалите мозговые оболочки из каждого мозга с помощью щипцов с тонким наконечником. С помощью скальпеля соскребите серое вещество с мозга по одному и перенесите изолированный материал в чашки Петри, содержащие 20 миллилитров DMEM/F-12, помещенных на лед. Для первоначальной фрагментации пропустите материал серого вещества через 50-миллилитровый шприц без иглы.

Повторите эту процедуру для всех мозгов и объедините собранный серый материал вместе. Перенесите выделенный материал серого вещества со средой DMEM/F-12 в трубку измельчителя ручного гомогенизатора тканей. Гомогенизируйте материал, сделав восемь движений вверх и вниз свободным пестиком, а затем восемь движений вверх и вниз тугим пестом.

Затем изолируйте капилляры, отфильтровав гомогенат с помощью 500-миллилитровой бутылки с синей крышкой с держателем фильтра и фильтрующей сеткой 140 микрон. Поместите капилляросодержащие фильтры в чашки Петри с раствором для варгана. Затем инкубируйте чашки Петри при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа на орбитальном вибростенде со скоростью 180 оборотов в минуту или осторожно помешивайте их каждые 10 минут.

Через час смойте капилляры с фильтров суспензией из чашки Петри. Затем разделите суспензию из трех чашек на две 50-миллилитровые трубки и остановите переваривание, добавив по 10 миллилитров DMEM/F-12 в каждую 50-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клеточные суспензии при температуре 250 умножить на g, четыре градуса Цельсия в течение пяти минут.

После этого аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 10 миллилитрах DMEM/F-12. Затем добавьте еще 20 миллилитров DMEM/F-12 в каждую пробирку. Чтобы оптимизировать условия для прикрепления ПБЭС, добавьте в колбу Т-75 раствор для нанесения покрытия, в результате чего конечные концентрации коллагена составляют 150 мкг на миллилитр и фибронектина при 50 мкг на миллилитр, а также путем дистиллированной воды, следя за тем, чтобы раствор покрывал всю поверхность.

Далее разморозьте капилляры на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Чтобы удалить замерзающую среду, вращайте капилляры при температуре 250 раз g, четыре градуса Цельсия, в течение семи минут. После этого тщательно отсасывайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном-двух миллилитрах 10-миллилитровой аликвоты.

После этого перенесите капиллярную суспензию на колбу с покрытием Т-75, и аккуратно наклоните колбу, чтобы обеспечить равномерное распределение по поверхности. Поместите колбу Т-75 при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После ночной инкубации приготовьте 10 миллилитров питательной среды PBEC, дополненной пуромицином в дозе четыре микрограмма на миллилитр на одну колбу Т-75 и выполните смену среды.

Затем подготовьте проницаемые мембранные вставки для посева PBEC, покрыв их коллагеном IV в концентрации 500 мкг на миллилитр и фибронектином в концентрации 100 мкг на миллилитр, а также дистиллированной водой. Добавьте трипсин в клетки, добавив два миллилитра раствора трипсина-ЭДТА в колбу Т-75, и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, на пять-семь минут. Чтобы отделить эндотелиальные клетки мозга, осторожно постучите кончиками пальцев по боковой стороне колбы Т-75.

Затем переложите клеточный раствор в 15-миллилитровую пробирку и раскрутите эндотелиальные клетки мозга путем центрифугирования при температуре 250 раз g, четырех градусах Цельсия, в течение семи минут. После этого осторожно удалите надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды. Затем добавьте еще два миллилитра среды, чтобы довести общий объем до трех миллилитров.

Подсчитайте количество ячеек вручную с помощью камеры подсчета ячеек или автоматической системы подсчета ячеек. Для бесконтактной кокультуры перенесите вкладыши в лунки, в которых есть астроциты, которые накануне были обновлены средой для роста астроцитов. На следующий день замените среду на проницаемых мембранных вставках, содержащих ПБЭЦ.

Затем тщательно отсасывайте среду из лунок и добавьте в каждую лунку по 750 микролитров дифференцировочной среды. После этого тщательно отсасывайте среду из вкладышей и добавьте 500 микролитров дифференцировочной среды на каждую вставку. Затем добавьте оставшиеся 750 микролитров среды для дифференцировки в каждую лунку для астроцитов.

После этого инкубируйте клетки со средой для дифференцировки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, до следующего дня. На следующий день после стимуляции клеток дифференцировочной средой подготовьте систему камер измерения сопротивления тканей к измерениям TEER, промыв камеру два раза бидистиллированной водой, один раз 70%-ным этанолом в течение пяти минут и еще два раза бидистиллированной водой. Затем подключите камеру к системе, добавьте четыре миллилитра DMEM/F-12 в камеру для измерения сопротивления тканей и дайте ей постоять при комнатной температуре примерно 30 минут.

После этого выполните измерения TEER, осторожно поместив вставки в камеру для измерения сопротивления тканей. Вот изображения фазово-контрастной микроскопии PBEC, культур и астроцитов, полученные в течение пяти дней. Очищенные фрагменты капилляров в первый день посева показали наличие как капилляров, так и загрязняющих клеток, которые после изменения среды на второй день и дополнительного дня роста показали отбор на ПБЭС, начав их рост из фрагментов капилляров.

Сливающиеся монослои ПБЭС обычно достигались на четвертый-шестой день, когда ПБЭС демонстрировали веретенообразную морфологию и были выровнены в продольном направлении. Крысиные астроциты, посеянные в донных лунках, обычно пролиферировали в сливающиеся слои в течение пяти дней и использовались для бесконтактных моделей кокультуры после двух недель роста. После освоения этой техники ее можно сделать за семь часов.

После своего развития этот метод проложил путь для исследователей к изучению доставки лекарств и трафика рецепторов в плотных и поляризованных эндотелиальных клетках мозга. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать модель гематоэнцефалического барьера in vitro, которую можно использовать для новых исследований, которые невозможно провести in vivo.