Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Общей целью этого метода является обнаружение отложений белковых агрегатов как в клинических, так и в научных условиях. Описано окрашивание гептаформилтиофеном уксусной кислотой и анализ тканей на животных моделях прионной болезни и болезни Альцгеймера. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области амилоида, такие как наличие небольших количеств белковых агрегатов и их внутренние конформационные вариации.

Преимущество этой методики в том, что она более избирательна и более чувствительна, чем другие традиционные методики. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику различных заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белка, из-за возможности подгонки зондов для желаемой техники визуализации. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что hFTAA требует такой низкой концентрации окрашивания.

HFTAA также демонстрирует более длинную длину волны возбуждения и излучения по сравнению с обычными красителями. Приготовьте люминесцентный конъюгированный раствор олиготиофена путем ресуспендирования лиофилизированного hFTAA в двух миллимолярах гидроксида натрия для получения одного миллиграмма на миллилитр исходного раствора. Переложите исходный раствор в стеклянный флакон и храните при температуре четыре градуса Цельсия.

Если используются фиксированные формалином и залитые парафином срезы, депарафинизируйте в ксилоле в течение ночи. В день окрашивания погрузите срезы в последовательные ванны с содержанием 99% этанола, 70% этанола, dH2O и PBS на десять минут каждый раз. Затем дайте участкам ткани высохнуть в условиях окружающей среды.

Пока ткань сохнет, приготовьте рабочий раствор hFTAA, разведив подвой к 10 000 в PBS. Когда ткань высохнет, добавьте капли рабочего раствора hFTAA на каждый участок ткани, чтобы покрыть его. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.

Смойте раствор для окрашивания 500 микролитрами PBS, а затем погрузите предметное стекло в ванну PBS на 10 минут. После того, как секция высохнет в условиях окружающей среды, выполните монтаж с использованием флуоресцентной монтажной среды. Дайте монтажному материалу осесть на ночь.

Обнаружение амилоида может быть выполнено непосредственно после монтажа, или даже без монтажа. Однако, если целью эксперимента является сбор высококачественной спектральной информации, предпочтительна ночная инкубация. Откройте программное обеспечение микроскопа, присвойте проекту имя, выберите спектральное изображение и начните съемку.

Выделите интересующий объект через окуляр с помощью фильтра возбуждения 436 нм и сместите световой путь к камере. В диспетчере данных случая выберите тип выборки спектрально, пометьте образец и нажмите кнопку «Получить». Откроется окно сбора данных.

В разделе «Спектральная визуализация» откройте меню настроек, выберите «Свойства захвата» и установите спектральный диапазон от 460 до 700, качество скорости на максимальной скорости и тип измерения — «Узкие фильтры газового лазера». Закройте диалоговое окно. В меню изображения выберите live full.

На панели значка отключите окантовку. Выберите регион для изображения и убедитесь, что пиковое значение памяти меньше 800 мегабайт. Установите время экспозиции на значение, которое дает общую яркость изображения в диапазоне от 1 000 до 3 000.

На панели значка нажмите на цветную камеру. Начнется приобретение. Когда получение изображения будет завершено, нажмите кнопку "Сохранить" в диалоговом окне "Получение спектрального изображения" и "Новая ячейка" в диалоговом окне "Диспетчер данных случая".

В менеджере данных случая откройте собранное изображение с помощью кнопки «Начать анализ». Откроется окно анализа данных. Спектральная информация может быть собрана из каждого пикселя изображения путем выбора ROI с помощью диалогового окна спектрального отображения.

Выберите «Определить» и выберите ROI в соответствующих областях изображения. Сохраните спектральные данные в виде текстового файла с помощью кнопки Lib. Сохраненный файл txt можно импортировать в любое программное обеспечение для анализа.

Откройте программное обеспечение микроскопа и начните с настройки конфокального микроскопа. Установите интенсивность лазера на 0,2%, точечное отверстие на одну единицу Эйри, размер кадра на 1,024 на 1,024 пикселя, скорость сканирования как семь в среднем за 16 сканирований и битовую глубину как восемь бит. Чтобы собрать спектр излучения, выберите режим лямбда и установите аргоновый лазер на 488 нанометров.

Собирайте излучение в диапазоне от 499 до 691 нанометра с помощью 22 каналов в 32-канальном детекторе воздуха. Установите усиление на 755. Нажмите кнопку live и измените палитру на индикатор дальности и отрегулируйте усиление, чтобы разрешить неперегруженные пиксели красным цветом.

Нажмите кнопку стоп, а затем сделайте снимок с помощью кнопки привязки. Чтобы получить одноканальное изображение, выберите опцию интеллектуальной настройки. Выберите FITC и Alexa 532.

Выберите линейное разъединение и примените. Отрегулируйте усиление, чтобы учесть неперегруженные пиксели. Для FITC установите усиление на 693, а для Alexa 532 установите усиление на 433 в режиме реального времени.

Нажмите кнопку стоп, а затем сделайте снимок с помощью кнопки привязки. Переключите микроскоп в режим FLIM. Установите отверстие на 20, длину волны возбуждения на 490 нанометров и интенсивность лазера на 0,5%. Используйте импульсные лазеры с частотой 40 мегагерц.

В программном обеспечении FLIM настройте подсчет фотонов с точностью более 550 нанометров. В окне параметров отображения следите за подсчетом фотонов до тех пор, пока максимальное количество фотонов не составит около 4 000 фотонов. Сохраните файл и экспортируйте его как образ SPC.

На этом изображении показаны тельца Мэллори-Денка, состоящие из кератиновых агрегатов в гепатоцитах печени, противопоставленных DAPI. Здесь проявляются положительные включения Р62 при спорадических включениях миозита скелетной мышечной ткани. На этом изображении показано амилоидное включение островкового амилоидного полипептида в поджелудочной железе человека.

Показано отложение амилоидной легкой цепи иммуноглобулина в кишечнике человека. На этом изображении показаны отложения агрегатов прионных белков овечьего скрейпи в мозге мыши. Здесь показаны агрегаты прионных белков в мозге мыши, инфицированной хронической болезнью истощения.

На этом изображении показаны А-бета-амилоидные бляшки в мозге мыши APP23. На этом изображении показана патология A-beta в мозге мыши APP-PS1. Эти мазки биопсии жира из диагностических образцов транстиретина амилоида у пациентов были оценены от одного до четырех в соответствии со стандартной оценкой Congo Red.

Желтые участки показывают окрашенные hFTAA отложения транстиретина амилоида, а синие — аутофлуоресценцию из жировой ткани. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о окрашивании в достаточно низкой концентрации. Также не забывайте использовать длинночастотные фильтры для получения максимального контраста, а также избегайте автофлуоресценции и флуоресценции фонового окрашивания.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунофлюоресценция, для идентификации агрегированного белка и идентификации коагрегированных белков. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области амилоидоза к изучению структур белковых агрегатов, а органической химии — к разработке новых зондов для этих мишеней. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить окрашивание LCO, чтобы визуализировать каждый из них с помощью различных техник.