Роговицы тканевая инженерия: В пробирке модель стромальные нерва взаимодействий человека роговицы

Общая цель этого протокола заключается в исследовании клеточных взаимодействий между стромальными клетками роговицы человека и нейрональными клетками в их естественном внеклеточном матриксе. Протокол может быть расширен для изучения заболеваний роговицы и дистрофий, таких как кератоконус, диабетическая кератопатия и дистрофия Фукса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии роговицы человека, выявив основные механизмы и дефекты взаимодействия нервов стромы во время конкретного заболевания роговицы или дистрофии.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что клеткам разрешается секретировать свой собственный внеклеточный матрикс in vitro, что обеспечивает лучшую и более точную модель реальной ткани роговицы человека in vivo. Применение этого метода распространяется и на терапию заболеваний роговицы, поскольку оценка межклеточных и внеклеточных матриксных взаимодействий обеспечит точное представление ткани роговицы и позволит разработать более целенаправленные лекарства. Теперь этот метод может дать представление о повреждении и регенерации роговичных нервов.

Он также может быть применен к другим системам, таким как скрининг и разработка лекарств. После получения образцов тканей роговицы человека перенесите ткани в чашку площадью 21,5 квадратного сантиметра, содержащую два миллилитра стерильного фосфатного буферного раствора Дульбекко. Расположите купол роговицы лицевой стороной вверх и с помощью лезвия бритвы под углом 45 градусов соскребите эпителиальный слой.

Далее переверните купол роговицы лицевой стороной вниз и тщательно соскребите эндотелий со стромы. Промойте стромальную ткань с помощью DPBS. Держите стромальные части влажными с помощью DPBS и используйте хирургическое лезвие No 10, чтобы разрезать стромальные ткани на мелкие кусочки.

С помощью стерильных щипцов перенесите кусочки стромы в колбу для культуры T25 без среды. Дайте эксплантам прилипнуть ко дну колбы при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 30-40 минут. После точного разрезания стромальной ткани осторожно перенесите колбу в инкубатор.

Важно подождать от 30 до 40 минут, а затем медленно добавлять носитель. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения полного прилегания эксплантов и предотвращения их отслоения. После прилипания медленно добавьте в колбу Eagle's Minimum Essential Medium, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика-антимикотика, не нарушая экспланты.

Аккуратно поместите колбу в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Оставьте экспланты в покое до тех пор, пока клетки не начнут изолироваться и мигрировать в колбе. Примерно через две-четыре недели клетки должны достичь 100% конфлюенции.

После 100% слияния пропустите клетки, удалив питательную среду для тканей, и промойте клетки DPBS. Добавьте в клетки трипсин, а затем инкубируйте при 37 градусах Цельсия. Примерно через пять минут просмотрите клетки под помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что они отделились.

Остановите протеолиз, добавив свежую среду, и перелейте клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при давлении 1000 x g для гранулирования ячеек. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и подвесьте клетки в свежей среде.

После проведения подсчета клеток засейте примерно один раз по 10-шесть клеток в колбе для культур Т75 со свежей средой для дальнейшего расширения. Чтобы собрать 3D-конструкцию, сначала пропустите и подсчитайте фибробласты роговицы человека, затем засейте примерно один раз по 10 до шести HCF на вставку из поликарбонатной мембраны с порами 0,4 микрона. Добавьте к верху конструкции 1,5 миллилитра свежей среды.

Затем пипеткой наденьте еще 1,5 миллилитра той же среды на дно каждой конструкции. Через 24 часа добавьте по 1,5 миллилитра среды, дополненной 0,5 миллимоляром витамина С, в верхнюю и нижнюю часть каждого конструктива. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех недель, добавляя свежую среду, содержащую витамин С, через день.

Это будет стимулировать клетки к секреции и сборке собственного внеклеточного матрикса. Через три недели добавьте восемь раз по 10 к третьим клеткам нейробластомы человека SH-SY5Y поверх ранее собранных 3D-конструкций. На этом этапе очень важно рассчитать точное количество клеток и подождать 24 часа до начала дифференцировки клеток.

После 24 часов инкубации инициируйте дифференцировку клеток SH-SY5Y, стимулируя клетки 1,5 мл EMEM с 10% FBS и 10 микромолярной ретиноевой кислотой. Затем добавьте на дно конструкции 1,5 миллилитра среды, содержащей витамин С. Ретиноевая кислота светочувствительна, поэтому этот этап следует выполнять в темное время суток.

Через пять дней, когда клетки достигнут фазы дифференцировки, добавьте в верхнюю часть конструкции 1,5 миллилитров бессывороточной среды, содержащей два наномоляра BDNF и 1% антибиотика-антимикотика. Добавьте свежую среду с добавлением витамина С на дно конструкции. Культивируйте клетки в течение двух дополнительных дней перед обработкой для дальнейшего анализа.

Это изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии с большим увеличением, полученное в результате 3D-самосборки, на котором видна поликарбонатная мембрана и стромальные клетки роговицы, расположенные сверху. На этом изображении показаны дифференцированные нейронные клетки, расположенные сверху, которые демонстрируют стромально-нейронное расположение клеток. Стрелки на изображении показывают нейронные клетки.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что ткань роговицы всегда должна быть влажной при разрезании эксплантов, а хирургические инструменты и лезвия должны быть стерильными. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить и использовать эту модель in vitro для исследования клеточных взаимодействий между клетками стромы роговицы человека и нейрональными клетками в их естественном внеклеточном матриксе. Не забывайте, что работа с BDNF, ретиноевой кислотой и хирургическими лезвиями может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение подходящей защитной одежды.