МикроРНК основе жидкого биопсия: Опыт плазмы Мирна подпись классификатора (MSC) для скрининга рака легких

Общая цель этой процедуры заключается в измерении уровней 24 циркулирующих микроРНК в плазме для определения риска развития рака легких у заядлых курильщиков старше 50 лет. Эти методы могут повысить экономическую эффективность программ скрининга низкодозной компьютерной томографии для раннего выявления рака легких за счет уменьшения количества ложноположительных узлов и, возможно, чрезмерной диагностики. Основное преимущество этого метода заключается в том, что секрецию микроРНК легко измерить с помощью стандартного оборудования, используемого в обычных молекулярных лабораториях.

Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы начали изучать роль микроокружения опухоли в развитии рака легких. МикроРНК отражают реакцию хозяина и динамическое взаимодействие между опухолью и ее микроокружением. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для лучшего понимания стандартной рабочей процедуры, которой следует следовать при этом типе молекулярного анализа.

Чтобы начать этот протокол, используйте вакуумные пробирки для сбора 10 миллилитров образца цельной крови. Хранить при комнатной температуре. Не храните цельную кровь при низкой температуре, например, при четырех градусах Цельсия, чтобы избежать теплового удара и лизиса клеток.

Это приводит нас к определенному высвобождению микроРНК. Центрифугируйте плазму в течение одного часа, чтобы отделить ее. При этом следует избегать контакта с лимфоцитарным кольцом.

Переложите надосадочную жидкость в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте надосадочную жидкость в тех же условиях. Распределите один миллилитр этой надосадочной жидкости плазмы в криопробирки объемом 1,5 миллилитра, стараясь не собирать фракцию плазмы со дна пробирки.

Чтобы начать выделение РНК, добавьте 200 микролитров предварительно охлажденного раствора OMG в 200 микролитров плазмы на каждый образец. Для обеспечения полной гомогенизации вихрь в течение 15-30 секунд. Чтобы гомогенизировать образец, добавьте 200 микролитров буфера для лизиса и 25 микролитров белка ASK на образец, и сделайте вихрь в течение 20 секунд.

Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в термомиксере в течение 15 минут. Далее выберите метод RSC mi-RNA Tissue и загрузите картридж для каждого образца на палубный лоток автоматического экстрактора нуклеиновых кислот, правильно разместив поршень. Перенесите лизат и добавьте пять микролитров DNазы в один раствор в соответствующие места в картридже прибора.

На дно каждой пробирки для элюирования добавьте 60 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Чтобы начать автоматическую очистку, запустите прогон. Храните общие образцы РНК при температуре 80 градусов Цельсия.

Чтобы преобразовать РНК в CDNA с помощью набора для обратной транскрипции Taq miroRNA, используйте праймерный инструмент Taq RT с интересующими нас микроРНК. В 1,5-миллилитровой пробирке, помещенной на лед, приготовьте реакционную смесь RT в соответствии с инструкцией набора. Затем добавьте 3 микролитра общей РНК на образец, до конечного объема 15 микролитров.

Выдерживайте на льду, в течение пяти минут. Наконец, загрузите образцы в амплификатор и запустите реакцию RT. Затем смешайте по 2,5 микролитра каждого продукта реакции RT с Taq Master Mix 2X и пулом Custom Taq.

Добавьте воду без нуклеаз до конечного объема 25 микролитров. Выполните реакцию предварительного амплификации в термоамплификаторе с использованием определенного теплового профиля. Затем разбавьте каждое средство, добавив 175 микролитров 0,1 XTE PH 8,0.

Сначала смешайте 1,13 микролитра разбавленного предварительно амплифицированного образца с 2X Taq Universal Master Mix в пробирке объемом 0,5 миллилитров. А затем добавить воду без нуклеаз. Для измерения плазменных уровней 24 специфических микроРНК на восьми образцах одновременно используют 384-луночную микрофлюидную микроРНК-карту Taq-матрицы.

Загрузите на карту до восьми реакций со смесью для ПЦР-реакций. Центрифугируйте пользовательскую карту при 311 умноженных на G в течение двух минут и запечатайте ее с помощью запечатывателя карт Array. Наконец, поместите карту в систему ПЦР в реальном времени и запустите реакцию ПЦР в реальном времени.

Для экстраполяции и анализа данных используйте соответствующее программное обеспечение и получайте исходные значения КТ. Установите автоматический базовый уровень для удаления фоновых сигналов и фиксированный порог 0,15 для всех анализов и образцов. Необходимо провести преаналитический этап контроля качества для выявления не поддающихся анализу образцов гемолизированной плазмы, в которых могут наблюдаться ложные результаты неспецифического высвобождения микроРНК клетками крови.

Спектрофотометрический анализ образцов плазмы, измеряющий коэффициент поглощения между длинами волн A414 и A375, показывает разницу между гемолизированными образцами, не поддающимися анализу, и негемолизированными образцами. Для выявления любых технических проблем оценивается производительность ОТ-КПЦР. Четыре качественные микрофлюидные карты приводят к ОТ-КПЦР с низкой производительностью, и в этом случае продукт предварительного усиления должен быть перезагружен на новую микрофлюидную карту.

Микрофлюидные карты хорошего качества обеспечивают хорошую производительность, а затем они подвергаются двум этапам постаналитического контроля качества. После выполнения этапов контроля качества применяется классификатор сигнатур микроРНК. Генерируются четыре сигнатуры соотношений микроРНК, составляющих МСК.

Риск заболевания, риск агрессивного заболевания, наличие заболевания и наличие агрессивного заболевания. Объединив четыре сигнатуры, уровень риска в конечном итоге определяется как низкий, средний или высокий. После освоения, за исключением одной недели хранения плазмы при температуре 80 градусов Цельсия, этот метод может быть выполнен за десять часов.

Анализируем восемь образцов одновременно. Классификатор сигнатур микроРНК был протестирован на более чем 10 000 образцов, собранных у более чем 4 000 добровольцев, включенных в скрининговое исследование BioMed Lancaster. Потенциально эти тесты могут обеспечить большую согласованность диагностического алгоритма.

Они также снижают затраты на скрининг. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание, позволить измерить уровни циркулирующих микроРНК, чтобы использовать их в качестве биомаркера для диагностики рака и других тяжелых заболеваний.