Долгосрочный живых изображений устройства для улучшения экспериментальных манипуляций личинок данио рерио

Общей целью изготовления этого устройства визуализации является создание модифицируемой платформы для микроскопического анализа заживления ран у живых личинок рыбок данио. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заживления ран, например, каков вклад реорганизации коллагеновых волокон и клеточных реакций в последующий рост тканей после травмы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ранение и визуализация происходят в пределах одного устройства, при этом отрастание хвоста не препятствует устройству.

Кроме того, множественные функциональные отсеки zWEDGI могут быть модифицированы независимо друг от друга, чтобы приспособиться к различным личиночным стадиям и множеству экспериментальных протоколов. Для начала смоделируем компонент PDMS устройства с требуемой геометрией и атрибутами в соответствии с текстовым протоколом. После печати форм с помощью фотополимерного 3D-принтера очистите формы с помощью тонкой щетки, денатурированного спирта в пульверизаторе и сжатого воздуха.

Аккуратно потрите и удалите неотвержденную смолу, особенно любой материал из областей микроканалов. Затем отверждите формы в ультрафиолетовом аппарате в течение 60 минут с каждой стороны, так как неотвержденная смола токсична для личинок рыбок данио. Используя наждачную бумагу с зернистостью 200, отшлифуйте полую сторону формы на ровной поверхности, пока все потолочные поверхности не соприкоснутся с наждачной бумагой.

С помощью наждачной бумаги с зернистостью 400 и 600 слегка шлифуйте постепенно, чтобы получить гладкие, ровные поверхности на всех геометрических поверхностях формы. Затем с помощью циферблатного индикатора измерьте глубину полости после шлифовки, чтобы убедиться, что она близка к проектной глубине. Очистите формы и стеклянные диски, поместив их в ультразвуковой очиститель, наполненный водой, на 30 минут или промойте под проточной водой.

Используйте изопропиловый спирт и отфильтрованный сжатый воздух для очистки и сушки пресс-форм и крышек. Подготовьте чистый стенд в качестве места для изготовления устройств, чтобы свести к минимуму загрязнение от мусора, переносимого по воздуху. Сделайте PDMS, налив основу и активатор в соотношении 5:1 в пластиковый стаканчик.

Деревянной крафтовой палочкой хорошо перемешайте в течение двух минут, помешивая гель на себя, как замешивая хлеб. Дегазируйте смесь в вакуумном эксикаторе в течение 25-45 минут, пока все пузырьки не исчезнут. Затем, используя шприц объемом 10 миллилитров, заполните полость каждой 3D-печатной формы примерно 0,75 миллилитров PDMS до тех пор, пока форма немного не переполнится мениском.

Дегазируйте заполненные формы в течение 45 минут, чтобы удалить дополнительные пузырьки, которые могли образоваться при заполнении. Приложите диск со стеклянной крышкой поверх заполненной PDMS формы, прижимая диск под углом, чтобы предотвратить попадание пузырей. Дайте излику PDMS вытесниться при наложении стеклянной крышки диска.

Затем с помощью небольшого храпового зажима плотно прижмите диск крышки к форме. Для повышения эффективности можно использовать многозажимное устройство. Отверждите устройство PDMS и зажатые формы при температуре 100 градусов Цельсия в духовке не менее 90 минут.

Затем выньте формочки из духовки и дайте им остыть, пока с ними не станет легко обращаться. Зажмите пресс-форму, содержащую отвержденное устройство PDMS, в настольных тисках так, чтобы геометрия формы была обращена вверх, параллельно столу рабочей станции. Начните извлекать устройство PDMS с помощью пинцета с плоским наконечником, чтобы освободить метчик PDMS от формы.

Затем обработайте пинцетом по периметру формы. PDMS необходимо отверждать не менее 90 минут при температуре 100 градусов Цельсия, иначе он останется липким и прилипнет к форме. Хорошим признаком того, что вы отверждали устройство достаточно долго, является то, что вы действительно увидите пузырь воздуха на границе между пресс-формой и устройством PDMS, указывающий на то, что его можно легко удалить.

С помощью фильтрованного сжатого воздуха и пинцета аккуратно вытащите устройство из формы, держась за язычок и продувая воздух под устройством. Затем поместите устройство PDMS вверх ногами на внутреннюю часть крышки тарелки со стеклянным дном так, чтобы удерживающие туннельные клинья касались пластика. Затем поместите крышку чашки с перевернутым дном zWEDGI и соответствующую стеклянную нижнюю чашку в плазменный очиститель внутренним стеклом вверх.

Вакуумируйте камеру плазменной очистки до тех пор, пока давление не достигнет 500 миллиторр. Установите радиочастоту, или мощность РЧ, на высокую и подвергните устройство и тарелку воздействию РЧ-частоты примерно на две минуты. Затем медленно сбросьте давление в камере и верните прибор и посуду в чистую комнатную вытяжку.

Снимите устройство PDMS с крышки посуды. Затем переверните PDMS zWEDGI в правильное положение на стакане, осторожно расположив его на центральном отверстии стеклянной нижней чаши. Чтобы обеспечить прилегание PDMS к стеклу, используйте задний конец пинцета, чтобы надавить на мельчайшие геометрии микроканалов, сглаживая PDMS к краям.

Слегка надавите на устройство PDMS, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха не задерживаются под устройством. Добавьте в чашку 70%-ный этанол и с помощью микропипетки промойте каналы, в том числе через сдерживающий туннель. Затем удалите этанол и используйте двойную дистиллированную воду, чтобы промыть устройство два или три раза, прежде чем дать ему высохнуть на воздухе.

Наполните каналы обезжиренным молоком и выдержите прибор в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы свести к минимуму прилипание личинок к стеклянной крышке посуды. Затем осторожно погрузите устройство несколько раз в двойную дистиллированную воду для промывки и дайте ему высохнуть на воздухе вверх ногами. После обезболивания личинок согласно текстовому протоколу используйте несколько микролитров трикаина Е3 для предварительного смачивания каналов прибора.

С помощью наконечника пипетки с широким отверстием возьмите одну личинку и поместите ее в загрузочный канал. Затем с помощью наконечника пипетки или аналогичного инструмента ориентируйте личинку в загрузочной камере так, чтобы спинная сторона была обращена к более прямому краю загрузочной камеры, а хвост — к удерживающему туннелю. Осторожно отведите жидкость из раневой камеры, позволив личинке затекать в сдерживающий туннель.

Удалите большую часть жидкости, сохраняя влажность вокруг личинки. Личинка должна быть правильно ориентирована в удерживающий туннель, так как большая часть жидкости удаляется. Но вокруг личинок должно оставаться достаточное количество жидкости.

Ориентация может быть скорректирована после добавления агарозы, но должна быть выполнена до того, как агароза затвердеет. Пипеткой 1%LMP агароза в трикаине Е3 нанесите на голову личинки, заполнив загрузочную камеру, и дайте агарозе застыть вместе с личинкой в нужном положении. Добавляйте трикаин E3 в раневую камеру по мере необходимости для поддержания гидратации.

Затем повторите процесс загрузки для оставшихся двух каналов. С помощью иглы шприца осторожно удалите агарозу, которая просочилась через сдерживающий туннель в раневую камеру. Для нанесения ран, кратковременной визуализации или изоляции раны добавьте больше трикаина E3 поверх агарозы.

Чтобы ранить личинок в раневой камере, используйте лезвие стерильного скальпеля, чтобы пересечь хвостовой плавник позади хорды. При необходимости добавьте трикаин E3 и установите на место крышку чашки для культивирования. Установите прибор zWEDGI с личинками под наркозом на перевернутый микроскоп в предметную вставку, которая будет вмещать 60-миллиметровую стеклянную нижнюю чашку.

Расположите хвост личинок в самом верхнем канале, поворачивая тарелку по мере необходимости, чтобы хвост оказался в нужном положении. Представьте личинку так, как это требуется для конкретного эксперимента. По завершении эксперимента извлеките чашку zWEDGI из микроскопа.

После удаления личинок и агара в соответствии с текстовым протоколом используйте этанол и дистиллированную воду для очистки zWEDGI, как было показано ранее, и установите его вверх дном для сушки на воздухе. Храните накрытое устройство в прохладном, сухом месте. Здесь показаны изображения с помощью многофотонной микроскопии для второй гармоники или ГВГ-визуализации коллагеновых волокон в хвостовом плавнике, чтобы проиллюстрировать возможности визуализации zWEDGI.

Перед ранением ГСП обнаруживал коллагеновые волокна, которые расходятся от хорды к кончику плавника. Вскоре после ранения расстояние между кончиком сокращенного плавника и центром плавника увеличивается при расслаблении раны. zWEDGI позволяет собирать трехмерные данные с течением времени, обеспечивая более полное представление о динамических изменениях, происходящих в структуре внеклеточного матрикса.

Трехмерный характер сбора данных позволяет осуществлять пространственную реконструкцию с использованием программного обеспечения для рендеринга. Эти реконструкции и последующие варианты вращения иллюстрируют, что сокращение и расслабление плавника происходит не только в плоскости XY набора изображений, но и по оси Z, поскольку хвост сплющивается от завитка вверх сжатого состояния. После того, как многоразовые формы будут напечатаны, технология изготовления может быть выполнена за три-четыре часа.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что перед отверждением в PDMS не должны задерживаться пузырьки воздуха и что устройства должны отверждаться достаточно долго, прежде чем пытаться извлечь их из форм. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как локализованное применение лекарств, мечение антител или очистка РНК и белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как присутствие лекарств или ингибиторов влияет на заживление ран. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области заживления ран к изучению динамики коллагена, реакции иммунных клеток и восстановления тканей личинок рыбок данио.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить zWEDGI и использовать его для ранения и живой визуализации личинок рыбок данио. Не забывайте, что фотополимерные смолы для 3D-печати опасны для человека и токсичны для рыбок данио. Необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и использование маски для лица при работе с неотвержденными 3D-печатными деталями, а также обеспечение отверждения всей смолы, оставшейся на отпечатках, перед попыткой заполнения форм PDMS.