На основе дендример неравномерным Nanopatterns для локально клейкости поверхность управления: метод прямого хондрогенном дифференциация

Общая цель этого протокола заключается в получении крупномасштабных наноструктур на основе дендримеров, которые позволяют осуществлять наноразмерный контроль адгезии локальной поверхности. Описанный метод применяется для изучения клеточной адгезии и хондрогенной дифференцировки. Выпуклые наноузоры дендримеров позволяют локально контролировать адгезию поверхности на наноуровне.

Для создания наноузоров используются полинаномеры первого поколения, модифицированные пептидом клеевого клея RGD. Они характеризуются методами сканирования на основе микроскопии и используются в исследованиях клеточной адгезии и дифференцировки. Затем мы анализируем результаты микроскопии и иммуноокрашивания.

Первым делом необходимо подготовить рабочие субстраты. Изготовленные по индивидуальному заказу предметные стекла квадратного стекла изготавливаются путем резки предметных стекол с помощью микроскопического резака с алмазным наконечником. Сделайте горки размером 1,25 на 1,25 сантиметра.

Промойте предметные стекла деионизированной водой, а затем 96% этанолом и дайте им высохнуть на воздухе. Приготовьте 2%-ный раствор PLLA, добавив 200 миллиграммов PLLA в напорную трубку и добавив 10 миллилитров диоксана. Добавьте мешалку и плотно закройте трубку.

Прогрейте смесь в глицериновой ванне при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24 часов при слабом помешивании. Поместите стеклянные предметные стекла в стеклянный флакон с раствором PLLA на чистую горячую плиту при температуре 60 градусов по Цельсию. Подождите не менее 10 минут, чтобы достичь необходимой температуры.

Нанесите на стеклянные подложки с помощью PLLA методом центрифуга, поместив предметное стекло на столик для нанесения плового покрытия и запустив выбранную программу. Мы выбираем 3 000 об/мин в течение 30 секунд с ускорением 1 500 об/мин в секунду с предварительным шагом 500 об/мин через пять секунд при 300 об/мин в секунду, чтобы обеспечить однородное покрытие. Очки с отжимным покрытием можно хранить в холодильнике.

Приготовьте и обработайте ультразвуком в течение 10 минут раствор А, 0,77 мг на миллилитр раствора дендримера RGD-Cys-D1 в деионизированной воде. Затем приготовьте в деионизированной воде растворы дендримеров от 10 до 2% и от 10 до 5% растворов В и С соответственно. Ультразвуком нанесите раствор C в течение 10 минут и приготовьте следующие растворы дендримеров, D, E и F, также в деионизированной воде.

Раствор D, 2,5x10 до 8% раствора E, 10 до 8% и раствор F, 4 10 до 9%Храните эти растворы в холодильнике до использования. Вы выпускаетесь с помощью УФ-лампы кабины для клеточных культур с покрытием 18 PLLA в течение 13 минут, чтобы сделать их стерильными. Обрабатывайте каждый из растворов дендримеров ультразвуком в течение 10 минут.

Отфильтруйте растворы дендримеров через фильтры диаметром 0,22 мкм на предметных стеклах с покрытием PLLA в 12-луночной пластине под ламинарным потоком в кабине для клеточных культур. Оставьте их внутри кабины при комнатной температуре на 16 часов и промойте стерильной, деионизированной водой. Для положительных контрольных образцов готовят стерильный раствор фибронектина в PBS и инкубируют реплики с раствором в течение одного часа при комнатной температуре в кабине для культивирования клеток.

Вымойте их с помощью PBS. Оставшиеся три подложки с покрытием PLLA будут служить в качестве реплик для негативного контроля. Топография наноузора анализируется с помощью АСМ, работающей в режиме врезки в воздухе.

Установите в держатель наконечника АСМ кремниевый консоль с постоянной пружины 40 ньютонов на метр и резонансной частотой 300 килогерц. Когда подложка с наноузором находится на столике АСМ, подойдите к поверхности до контакта и выберите заданное амплитудное значение, позволяющее визуализировать конфигурацию дендримера без чрезмерного давления на поверхность. Зарегистрируйте не менее трех репрезентативных изображений размером 5x5 микрометров на каждую подложку трех независимых подложек в каждом условии.

Обработайте полученные изображения с помощью программного обеспечения для обработки АСМ. Выберите дендримеры на обработанных изображениях высоты АСМ и получите соответствующие пороги изображения. Получите точность частиц и используйте ее для получения минимальных расстояний между частицами.

Пусть минимальные расстояния между частицами в Z равны соответствующим точностям частиц, чтобы получить свечи управления вероятностью для минимальных межчастичных расстояний. Настройте цветовую шкалу графика, чтобы визуализировать области, где локальная поверхностная плотность RGD ниже 70 нанометров. Количественно оцените площадь этих областей, выбрав их на изображении и создав пороговое значение.

Используйте коммерческий жировой материал человека, полученный из мезенхимальных стволовых клеток из ранних пассажей, предпочтительно ниже пяти. Культивируйте их при температуре 37 градусов и 4,6% CO2 в среде для выращивания стволовых клеток до тех пор, пока не будет достигнуто 70 или 80% слияние. Засейте клетки с плотностью 3000 клеток на квадратный сантиметр на субстратах в среде, индуцирующей хондрогенез.

Меняйте среду каждые три дня. Стадию конденсации можно наблюдать с первого дня в культуре, а за ее эволюцией можно следить с помощью оптического фазово-контрастного микроскопа во всех лабораториях культивирования. Зафиксируйте клетки 10%-ным раствором формалина при комнатной температуре на 20 минут, а затем промойте PBS.

Заблокируйте фруральдегидные группы, добавив 50 миллимолярный раствор хлорида аммония в PBS. Оставить на 20 минут при комнатной температуре. Постирайте с помощью PBS.

Пермеабилизируйте клетки 0,1%-ным раствором сапонина в блокирующем растворе 1%-ного альбумина в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Инкубировать с первичными антителами в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. Постирайте с помощью PBS.

Инкубируйте со вторичными антителами в блокирующем растворе в течение часа при комнатной температуре, избегая воздействия света. Постирайте с помощью PBS и высушите. Нанесите на образцы монтажный материал для микроскопии и аккуратно накройте их покровными стеклами.

Визуализируйте иммуноокрашенные образцы на фокальный адгезионный белок паксиллин после одного дня хондрогенной индукции, а также на ранний хондрогенный маркер, коллаген II альфа I после пяти дней хондрогенной индукции, используя вертикальный конфокальный микроскоп. Собирайте срезы с репрезентативным интервалом, например 0,5 или 1 микрометр. Отфильтруйте изображения, окрашенные на паксиллин, из базальной зоны клеточных конденсатов.

Удалите фон, сгладьте и преобразуйте в восьмибитные файлы. Сделайте их двоичными, установив эмпирически выбранный порог. Обрабатывайте не менее трех клеточных конденсатов в одном условии из трех независимых образцов.

Количественно определите выбранные площади и выразите их в виде соответствующего процента площади, деленного на количество ядров клеток на изображении. Чтобы количественно оценить окрашивание коллагена II альфа I, создайте конфокальные Z-проекции. Отфильтруйте полученные изображения, удалите фон, сгладьте и установите порог.

Количественно оцените сумму прогнозируемой площади, максимума коллагена II, альфа I площади на образец по отношению к площади соответствующего клеточного конденсата. Различные конфигурации наноузоров могут быть получены путем изменения начальной концентрации дендримера в растворе. Наноузоры могут быть визуализированы с помощью анализа АСМ и графиков вероятностных контуров для минимального расстояния между частицами.

Они выделяют области на поверхности с самой высокой локальной поверхностной плотностью RGD. Наношаблоны дендримеров используются в исследованиях клеточной адгезии. Адгезия увеличивается с увеличением локальной поверхностной плотности РГД.

Для положительного контроля и поверхностей, содержащих агрегаты дендримеров, эта корреляция теряется. В хондрогенезе было проверено влияние локальной поверхностной плотности РГД, как конденсации клеток, так и дифференцировке ячеек способствуют нанопаттерны, обладающие промежуточной адгезией. В заключение, наноузор на основе дендримера используется методом трех таблиц для рассмотрения влияния локальной плотности RGD на реакцию клетки.

Нанопаттерны более эффективно поддерживают клеточную адгезию на соответствующей гомогенной поверхности, обычно используемой в клеточных культурах. В экспериментах по дифференцировке промежуточная адгезия клеток к субстрату способствовала конденсации мезенхимальных клеток и ранней хроногенной дифференцировке. Благодаря простоте модификации периферического роста дендримеров, описанный здесь метод может быть в дальнейшем распространен на все избыточные ревматические слои, оказывающие влияние на плотность клеток.