Реальном времени дрожат индуцированной Assay преобразования для обнаружения CWD прионов в фекалии

Общая цель этого протокола для конверсионного анализа, вызванного дрожанием, в режиме реального времени состоит в том, чтобы обеспечить чувствительное обнаружение прионов хронической болезни истощения в образцах кала шейки матки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований CWD, такие как когда в кале находятся инфицированные прионы CWD шейки матки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она специфична, чувствительна и обеспечивает высокую пропускную способность образцов.

Демонстрировать процедуру будет Джинни Ченг, лаборант из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, добавьте один грамм калового материала в пробирку, содержащую 10 миллилитров буфера для экстракта кала. С помощью диссоциатора с заданной программой для белков гомогенизируйте фекальные гранулы в течение одной минуты при комнатной температуре.

Повторите это два-три раза, пока образцы кала не станут полностью гомогенизированными. Затем с помощью парапленки запечатайте пробирки и поместите их на качающуюся платформу или вращающийся шейкер на часовую инкубацию при комнатной температуре. После этого центрифугируйте при 18 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

Соберите надосадочную жидкость и распределите их по 1,5 миллилитровым пробиркам. Хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к использованию. Чтобы начать метод осаждения фосфовольфрамовой кислоты натрия, добавьте 250 микролитров саркозила к одному миллилитру экстракта фекального белка.

С помощью парапленки заклейте трубку. Поместите трубку в термомиксер и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут при постоянном встряхивании при 1 400 оборотах в минуту. После этого добавьте исходный раствор, содержащий 10% фосфовольфрамовой кислоты натрия и 170 миллимоляров хлорида магния, таким образом, чтобы конечная концентрация фосфовольфрамовой кислоты натрия в образцах составила 3%. Перенесите образцы в термомиксер и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов с постоянным встряхиванием при 400 об/мин.

Затем центрифугируйте при 15 800 g в течение 30 минут при 14 градусах Цельсия. Осторожно удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы, повторно суспендируя их в буфере для промывки. Затем центрифугируйте при 15 800 г в течение 15 минут при 14 градусах Цельсия.

Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах буфера для разведения RT-QuIC. Храните обработанные образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к проведению анализа RT-QuIC. Для начала добавьте 0,032 грамма Тиофлавина Т в 10 миллилитров двойной дистиллированной воды, чтобы приготовить свежий 10 миллимолярный стоковый раствор Тиофлавина Т.

Затем используйте воду двойной дистилляции для разведения исходного раствора в соотношении один к 10, в результате чего конечная концентрация тиофлавина Т составляет один миллимоляр. С помощью шприца, оснащенного дисковым фильтром Acro диаметром 0,2 микрометра, отфильтруйте раствор тиофлавина Т в одном миллимоляре. Затем разморозьте самый рекомбинантный субстрат прионного белка. Загрузите 500 микролитров субстрата рекомбинантного прионного белка за один раз в 100-килограммовые фильтрующие микротрубки с эксклюзионным фильтром размера Дальтона.

Центрифугируйте при 14 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого переложите элюированный субстрат в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия до готовности к использованию.

Далее разморозьте хранящийся буфер разбавления RT-QuIC. Разведите семена и приготовьте исходные растворы и реакционную смесь RT-QuIC, как указано в текстовом протоколе. С помощью пипетки с фильтрующим наконечником перемешайте реакционную смесь пипетированием вверх и вниз.

Вылейте смесь в резервуар для дозирования объемом 50 миллилитров. С помощью многоканальной пипетки загрузите 98 микролитров реакционной смеси RT-QuIC в каждую лунку 96-луночного оптического дна. В каждую реакцию добавьте по два микролитра либо неразбавленного, либо в 10 раз последовательно разведенного экстракта фекального белка.

Затем используйте герметизирующую ленту для запечатывания пластины. Инкубировать в планшетном считывателе при температуре 42 градуса Цельсия в течение 25 часов с повторяющимися циклами по одной минуте двойного орбитального встряхивания при 700 об/мин и одной минуте отдыха на протяжении всей инкубации. Тем временем определите параметры измерения флуоресценции, как указано в текстовом протоколе.

Через 25 часов снимите пластину со считывателя пластин. Вращайте пластину при давлении 3 000 г в течение трех минут, чтобы избежать потенциального загрязнения между лунками. Далее снимите пломбу с пластины.

Приготовьте новую пластину, добавив 90 микролитров реакционной смеси RT-QuIC, содержащей свежий субстрат и свежий флуоресцентный краситель Тиофлавин Т. Переложите по 10 микролитров из каждой лунки первой пластины на вновь подготовленную 96-луночную пластину. Используйте уплотнительную ленту для герметизации новой пластины.

После определения настроек измерения флуоресценции продолжайте анализ еще в течение 50 часов. Считывайте и документируйте сигнал флуоресценции тиофлавина Т для каждой лунки каждые 15 минут. Затем соберите и нанесите на график данные, как указано в текстовом протоколе.

В этом исследовании фекальный материал неинфицированного лося или оленя-мула гомогенизируется в буфере для экстракта кала для получения конечной концентрации образца 10%. Некоторые гомогенаты затем обрабатываются и концентрируются в 10 раз путем осаждения фосфовольфрамовой кислоты натрия. В то время как в очищенных образцах наблюдается снижение спонтанных превращений, все образцы показали низкие сигналы флуоресценции в образцах с положительным результатом исследования кала CWD. Для улучшения амплификации прионов и повышения чувствительности детектирования предусмотрен этап замены подложки.

Образцы, подвергшиеся замене субстрата в рамках протокола RT-QuIC, демонстрируют повышение чувствительности и специфичности обнаружения: 14 из 18 образцов оказались положительными, и ни один из отрицательных контрольных образцов не был зарегистрирован как ложноположительный. После освоения подготовка фекального экстракта и концентрирование PRP/SCRP могут быть выполнены примерно за четыре часа, а анализ RT-QuIC может быть проведен примерно через 1/1-2 часа, если он выполнен правильно. При проведении процедуры важно помнить о необходимости фильтровать субстрат, но ни в коем случае не

После процедуры можно использовать другие методы, такие как вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, насколько устойчивы протеазы к получаемым продуктам. После своего развития этот метод проложил путь ученым в области исследования прионов к изучению присутствия прионов у живых животных путем тестирования образцов фекалий. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как готовить и концентрировать PRP/SCRP из фекальных экстрактов и как выполнять модифицированный анализ RT-QuIC для получения чувствительного и специфического обнаружения прионов.

Не забывайте, что работа с прионами может быть чрезвычайно опасной, и что важно носить надлежащие СИЗ и работать под шкафом биобезопасности во время выполнения процедуры.