Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков

Общая цель этого метода заключается в очистке ДНК вируса простого герпеса первого типа из инфицированных клеток для протеомного анализа белков, ассоциированных с вирусным геномом. Этот метод дает ключевую информацию о влиянии клеточных факторов и инфекции, вызванной вирусом герпеса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может быть адаптирован для непосредственной очистки различных популяций вирусной ДНК из инфицированных клеток, что позволяет анализировать множественные аспекты инфекции.

Начните эту процедуру с культивирования пяти клеток MRC, как описано в текстовом протоколе. Затем разведите ВПГ-1 в холодном трис-буферном растворе или TBS. Для выполнения следующих действий важно выключить воздуходувку и колпак для культуры тканей, чтобы предотвратить высыхание клеток.

С помощью пипетки переложите питательную среду из клеток MRC 5 в стерильную бутылку, чтобы добавить ее обратно в клетки после заражения. Заражайте клетки, добавляя в клетки семь миллилитров разведенного вируса. Качайте клетки каждые 10 минут в течение одного часа при комнатной температуре.

После абсорбции аспирируйте иннокулум, промойте клетки 50 миллилитрами TBS комнатной температуры и замените исходную питательную среду. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии 5% углекислого газа. После начала репликации вирусной ДНК, примерно через четыре часа после заражения, пометьте реплицирующуюся вирусную ДНК.

Для этого разведите EdC в одном миллилитре питательной среды и добавьте его в среду для культивирования клеток инфицированных клеток на два-четыре часа. Чтобы собрать ядра, замените питательную среду 20 миллилитрами буфера для экстракции ядер и инкубируйте в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия с редким покачиванием. После инкубации соскребите ядра с пластины с помощью клеточного скребка и перенесите их в 50-миллилитровую коническую трубку со льдом.

Центрифугируйте в течение 10 минут при температуре 2 500 x g и четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать ядра. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно выбейте ядерную гранулу в 10 миллилитрах фосфатного буферного раствора или PBS и переложите ее в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Затем центрифугируйте образец, как и раньше. После полного удаления PBS повторно суспендируйте ядерную гранулу в 10 миллилитрах смеси клик-реакции, осторожно пятикратно пипетируя вверх и вниз 10-миллилитровой пипеткой. Вращайте образец в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия, прежде чем гранулировать ядра, как раньше.

Полностью удалите смесь быстрой реакции, затем промойте гранулу, аккуратно повторно суспензив ее в 10 миллилитрах PBS и снова центрифугируя. Теперь осторожно повторно суспендируйте ядерную таблетку в одном миллилитре PBS и переложите раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. После центрифугирования полностью удалите PBS и заморозьте гранулу в жидком азоте.

На этом этапе гранулы можно хранить при температуре 80 градусов Цельсия или продолжить процедуру. Чтобы лизировать ядра и фрагментировать ДНК, повторно суспендируйте размороженные ядра в 500 микролитрах буфера B1 путем пипетирования вверх и вниз. Выдержать суспензию на льду в течение 45 минут.

Затем обработайте образцы ультразвуком шесть раз в течение 30 секунд каждый с амплитудой 40% с помощью трехмиллиметрового зонда с микронаконечником. Поместите образцы на лед не менее чем на 30 секунд между импульсами. После ультразвуковой обработки образцы должны выглядеть прозрачными, не мутными.

Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при 14 000 x G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Размер гранул должен существенно уменьшиться, отфильтровать надосадочную жидкость через сетчатое фильтр ячейки 100 микрон и сохранить поток. Затем добавьте 500 микролитров буфера B2 в отфильтрованную надосадочную жидкость.

Чтобы связать биотинилированную ДНК с шариками, покрытыми стрептавидином, приготовьте магнитные шарики стрептавидина, переложив 300 микролитров суспензии гранул в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Приготовьте одну трубочку бусин на образец. Промойте бусины три раза миллилитром буфера B2 путем вортексирования для повторного суспензирования, прикладывая магнит для разделения бусин и отсасывая буфер для промывки.

Затем добавьте 900 микролитров образца в промытые бусины. Остальная часть образца будет использована для выделения входной ДНК и белка. Поверните подвеску на ночь на четыре градуса Цельсия.

На следующий день поместите образцы в штатив для магнитных микрофужей и удалите надосадочную жидкость. Аккуратно повторно суспендируйте бусины в одном миллилитре буфера B2, прежде чем вращать при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Снова извлеките надосадочную жидкость с помощью магнитного штатива для микрофуговых пробирок.

На этот раз аккуратно повторно суспензируйте бусины в одном миллилитре буфера B3 и вращайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости из смеси шариков с помощью магнита повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах 2x буфера для образцов Laemmli, чтобы намекнуть на белковые комплексы ДНК. Далее прокипятите образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Сделайте смесь вихревой жидкостью, прежде чем быстро вращать образцы в микрофуге. Приложите образцы к магниту и перенесите их в новую пробирку. Наконец, заморозьте образцы и храните их при температуре 80 градусов по Цельсию.

Выполните анализ белка, как описано в текстовом протоколе. Мечение EdC проводилось в течение нуля, 20, 40 или 60 минут с последующей очисткой вирусной ДНК и ассоциированных белков. Элюированные белки подвергали окрашиванию синим цветом и вестерн-блоттингу антителами, специфичными для вирусных ДНК-связывающих белков, ICP4 и UL42.

Стрелкой отмечен стрептавидин, который был сорван с шариков во время элюирования, который присутствует при любых условиях. Белки, выделенные этим методом, затем подвергаются масс-спектрометрии. Круговая диаграмма иллюстрирует количество белков в каждой функциональной категории, которые были обнаружены связанными с типом вируса простого герпеса в геномах через шесть часов после заражения.

Более пристальный взгляд на белок-белковые взаимодействия между идентифицированными белками был проведен с использованием базы данных сети функциональных ассоциаций строковых белков. Результаты показывают субкомплексы белков, которые функционируют вместе в одном и том же биологическом процессе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить вирусную ДНК из инфицированных клеток для протеомного исследования белков, ассоциированных с вирусным геномом.

Эту методику можно выполнить за три-четыре дня. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о мерах предосторожности, чтобы предотвратить загрязнение образцов ДНКазой или протеазой. В дополнение к этой процедуре могут быть выполнены другие методы, такие как иммунофлуоресценция, для проверки природы вирусной ДНК, меченной EdC.

Этот метод проложил путь исследователям в области вирусологии герпеса к изучению функций белков хозяина и вирусной инфекции.