Чип основе трехмерной клеточной культуре в перфузии Микро-биореакторы

Здравствуйте, меня зовут Эрик Готвальд, и я научный сотрудник Института биологических интерфейсов Технологического института Уэра. И сегодня я хотел бы познакомить вас с нашей перфузированной микроактивной системой на основе чипа. Прежде чем мы сможем использовать чип в клеточных культурах, мы должны гидролизовать полимер и снизить уровень микроструктурированной области.

Это достигается путем простого погружения чипа в различные концентрации изопропанола, начиная со 100%. Я погружаю чип всего на несколько секунд в каждую концентрацию, и последним шагом является просто вода. После этого чип высушивается, и, наконец, мы должны покрыть чип коллагеном, одним раствором для облегчения адгезии клеток к полимеру. Это делается путем капания всего нескольких капель коллагена, одного раствора поверх микроструктурированной области, и в таком состоянии чип инкубируется при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

После ночной инкубации с раствором коллагена один раствор удаляется и чип промывается стерильным PBS После этого PBS также удаляется, и чип теперь готов к инокуляции клеток. Теперь мы привьем клеточный корабль суспензией одиночных клеток, и это будет сделано, просто поместив 150 микролитров клеточной суспензии на вершину микроструктурированной области. После депонирования ячеек чип инкубируют в течение трех часов при температуре 37 градусов в инкубаторе.

После трехчасового инкубационного периода чип извлекается из инкубатора и теперь готов к введению в эктор. Для этого эктор вынимают из стерильной упаковки и стерильность достигается за счет гамма-облучения этой прозрачной фольги. Так что нам остается только открыть упаковку и снять эктор.

Далее мы вставим верхнюю часть бутылки в этот резервуар для среды, чтобы мы могли разобрать корпус биореактора для установки чипа. После открытия корпуса биореактора мы можем вставить чип теперь, что достигается путем простого помещения чипа в паз корпуса биореактора, и теперь бактор можно снова собрать. В конечном итоге нам нужно подключить стерильные фильтры к резервуару для среды и одному порту для стерильного отбора проб.

Для измерения фактического напряжения кислорода в замкнутом контуре циркуляции мы вставим два датчика кислорода, просто установив их между этими двумя разъемами. Теперь бактор готов к заполнению питательной средой. Теперь бакторная система готова к заполнению средой для клеточных культур, и это достигается простым подключением замкнутого контура циркуляции к роликовому насосу.

Тем самым мы одновременно понизим весь бакторный оборот. Как вы можете видеть здесь, в окне Эктора, вы можете видеть, как среда, идущая снизу, поднимается и поднимается, оставляя бактор наверху. Перед тем, как поместить систему Bactor в инкубатор, мы контролируем заполнение циркуляционного контура без пузырьков.

Теперь система полностью заполнена средой для культивирования клеток и мы можем перенести биореактор в инкубатор. Теперь мы поместим биректора в инкубационную камеру. А для этого сначала биректор подключается к роликовому насосу, в чем вы уже убедились незадолго до этого, а теперь эктор активно продавливается этой средой из бутылки.

А для поддержания концентрации кислорода в окружающей среде подключаем резервуар со средой к подаче газа. И, наконец, мы подключим два датчика кислорода к циркуляции, чтобы в режиме онлайн контролировать напряжение кислорода в системе. Теперь настройка завершена и может выполняться при условии, что вы спланировали эксперимент.

Одним из самых мощных инструментов при анализе органотипических функций клеток внутри контейнеров MicroCon является лазерный сканирующий микроскоп, который вы можете увидеть здесь. Лазерный сканирующий микроскоп дает нам возможность заглянуть внутрь каждого отдельного контейнера MicroCon без разрушения. А поскольку контейнеры MicroCon или чип можно использовать для обычных иммунофлуоресцентных методов иммуноокрашивания, мы можем обнаруживать все виды маркеров и органотипических функций внутри микроконтейнеров.

Как вы можете видеть здесь, на анимации этого чипа, дно полностью заполнено ячейками, а также стенки контейнера MicroCon. У нас есть много клеток, которые вполне живы, и у нас очень, очень мало мертвых клеток. На следующем рисунке показано, что мы можем обнаруживать все виды органотипических функций внутри контейнера MicroCon.

Как, например, в случае с гепатоцитами, выработка альбумина или Е может слышать экспрессию в клетках, которую вы можете хорошо увидеть здесь в наложении. Ядро окрашено в синий цвет. Эко здесь окрашен в зеленый цвет, а альбумин выражен или окрашен в красный цвет.

И, как вы можете видеть, все органотипические функции, которые вы ожидаете от гепатоцитов, хорошо выражены в этом виде 3D-культуры. Кроме того, мы рассмотрели еще один маркер гепатоцитов, и это был цитокератин 18, и этот рисунок показывает, что цитокератин 18 также хорошо экспрессируется в таких культурах. И это, надеюсь, убедит вас в том, что такого рода органотипические функции могут быть полезны и для других органотипических культур.

После окончания эксперимента Biore чип можно использовать для выделения всех видов клеточных компонентов, таких как, например, общая РНК. Как вы можете видеть здесь, здесь мы показываем вам общее количество потребляемой РНК, которая была выделена из системы биореактора. Эта общая РНК затем может быть использована для последующих приложений, таких как, например, ПЦР в реальном времени или, как вы можете видеть здесь, анализ микрочипов.

Кроме того, интактные клетки могут быть выделены из системы, и эти клетки затем могут быть использованы для обычного анализа проточной цитометрии. Как вы можете видеть, я надеюсь, что мы сможем показать вам, что система может быть полезна для всех видов применений, где требуются органотипические реакции, и что система может быть полезна для всех тех применений, которые мы до сих пор не рассматривали, например, для применения стволовых клеток.