Чип основе трехмерной клеточной культуре в перфузии Микро-биореакторы

Здравствуйте, я Эрик Готвальд, научный сотрудник Института биологических интерфейсов Технологического института Уэйра. Сегодня я хотел бы представить вам нашу микробиоактивную систему с перфузией на базе чипа. Прежде чем использовать чип для культивирования клеток, нам необходимо гидролизовать полимер и дегазировать микроструктурированную область.

Это достигается путем последовательного погружения чипа в растворы изопропанола разной концентрации, начиная со 100%. Чип погружают в каждый раствор всего на несколько секунд, а на заключительном этапе используют воду. После этого чип высушивают и, наконец, покрывают раствором коллагена I для облегчения адгезии клеток к полимеру. Для этого на микроструктурированную область наносят несколько капель раствора коллагена I, после чего чип инкубируют при температуре 4 °C в течение ночи.

После инкубации с раствором коллагена I в течение ночи раствор удаляют, и чип промывают стерильным PBS. Затем PBS также удаляют, после чего чип готов к инокуляции клеток. Теперь мы инокулируем чип суспензией одиночных клеток, просто нанося 150 µL суспензии клеток на микроструктурированную область. После нанесения клеток чип инкубируют в течение трех часов при 37 °C в инкубаторе.

По истечении трехчасового периода инкубации чип извлекают из инкубатора; теперь он готов к установке в эктор. Для этого эктор извлекают из стерильной упаковки; стерильность обеспечивается гамма-облучением данной прозрачной пленки. Таким образом, нам достаточно просто открыть упаковку и достать эктор.

Далее мы вставим верхнюю часть флакона в этот резервуар с питательной средой, чтобы иметь возможность разобрать корпус биореактора для установки чипа. После открытия корпуса биореактора можно вставить чип, просто поместив его в паз корпуса; после этого биореактор можно снова собрать. В завершение необходимо подсоединить к резервуару с питательной средой два стерильных фильтра и один стерильный порт для отбора проб.

Для измерения фактического парциального давления кислорода в замкнутом контуре циркуляции мы установим два датчика кислорода, просто закрепив их между этими двумя соединителями. Теперь биореактор готов к заполнению питательной средой. Система биореактора готова к заполнению средой для культивирования клеток, что осуществляется путем простого подключения замкнутого контура циркуляции к роликовому насосу.

Таким образом мы одновременно запустим циркуляцию во всем биореакторе. Как видно здесь в окне биореактора, среда поднимается снизу, постепенно заполняя объем и выходя из биореактора сверху. Перед тем как поместить систему биореактора в инкубатор, мы проверяем отсутствие пузырьков воздуха при заполнении контура циркуляции.

Теперь система полностью заполнена питательной средой для культур клеток, и мы можем перенести биореактор в инкубатор. Сейчас мы поместим биореактор в инкубационную камеру. Для этого сначала биореактор подключают к роликовому насосу, как вы видели совсем недавно, и теперь через него активно перфузируется среда из флакона.

Для поддержания концентрации кислорода в окружающей среде мы подключаем резервуар со средой к источнику газа. Наконец, мы подключим два датчика кислорода к системе циркуляции для онлайн-мониторинга парциального давления кислорода в системе. Теперь установка полностью готова и может работать в течение всего времени, предусмотренного дизайном вашего эксперимента.

Одним из наиболее эффективных инструментов при анализе органотипических функций клеток внутри контейнеров MicroCon является лазерный сканирующий микроскоп, который вы видите здесь. Лазерный сканирующий микроскоп дает нам возможность исследовать каждый отдельный контейнер MicroCon неразрушающим способом. Поскольку контейнеры MicroCon или чип могут быть использованы для традиционных методов иммуноокрашивания и иммунофлуоресценции, мы можем обнаруживать любые типы маркеров и органотипических функций внутри микроконтейнеров.

Как видно из анимации этого чипа, дно, а также стенки контейнера MicroCon полностью заполнены клетками. Мы видим большое количество жизнеспособных клеток и очень мало погибших. На следующем изображении показано, что мы можем обнаруживать любые органотипические функции внутри контейнера MicroCon.

Например, для гепатоцитов показаны продукция альбумина или экспрессия E-кадгерина в клетках, что наглядно видно здесь на совмещенном изображении. Ядра окрашены в синий цвет, E-кадгерин окрашен в зеленый, а альбумин экспрессируется или окрашен в красный.

Как видно из представленных данных, все органотипические функции, ожидаемые от гепатоцитов, полноценно проявляются в таком виде 3D-культуры. Кроме того, мы исследовали еще один маркер гепатоцитов — цитокератин 18; данное изображение демонстрирует, что цитокератин 18 также экспрессируется в подобных культурах. Надеемся, это убеждает вас в том, что такие органотипические функции могут быть полезны и для других органотипических культур.

После завершения эксперимента в системе Biore чип можно использовать для выделения различных клеточных компонентов, например, общей РНК. Как видно здесь, мы демонстрируем общую РНК, которая была выделена из системы биореактора. Эту общую РНК затем можно использовать для последующих приложений, таких как, например, ПЦР в реальном времени или, как показано здесь, микрочиповый анализ.

Кроме того, из системы можно выделить интактные клетки, которые затем можно использовать для стандартного анализа методом проточной цитометрии. Как вы видите, мы надеемся, что смогли продемонстрировать полезность данной системы для всех видов приложений, требующих органотипических реакций, а также для тех областей применения, которые мы до сих пор не рассматривали, например, для работы со стволовыми клетками.