Перекрывающиеся пептид библиотека для сопоставления Qa-1 Epitopes в протеине
20 декабря 2017 г.
QA-1 (HLA-E в человека) принадлежит к группе неклассических гистосовместимости 1b сложных молекул. Иммунизации с КК-1-привязки epitopes было показано для укрепления тканей специфические иммунные регулирования и улучшения несколько аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем перекрывающихся пептид библиотека стратегии для идентификации Qa-1 epitopes в протеине.
Общей целью этой процедуры является идентификация эпитопов Qa-1 в белках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунной регуляции и иммунотерапии. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что картированные пептиды, как известно, стимулируют Qa-1 ограниченные CD8 Т-клетки, и процедура проста в выполнении.
Применение этого метода распространяется на терапевтические разработки для иммуноопосредованных заболеваний, таких как рассеянный склероз. Хотя этот метод может дать представление об иммунорегуляции, опосредованной Qa-1 у животных, он также может быть применен к иммунной регуляции, опосредованной HLA-E у людей. Чтобы начать процедуру, спроектируйте библиотеку из 15-мерных пептидов, в которой соседние пептиды перекрываются в 11 аминокислотах.
Получают и восстанавливают пептиды в стерильных условиях. Для каждого пептида соедините пять миллиграммов пептида со 100 микролитрами диметилсульфоксида. Смешайте по 10 микролитров каждого пептидного бульона в чистой криопробирке объемом 1 миллилитров, чтобы приготовить бульон для бассейна OLP.
Затем загрузите по 20 микролитров каждой пептидной бульки в 96-луночный планшет с V-образным дном и разбавьте каждую бульку 80 микролитрами стерильной воды. Храните как оставшиеся запасы пептидов 50 миллиграммов на миллилитр, так и пластины с запасами пептидов 10 миллиграммов на миллилитр при температуре 20 градусов Цельсия. Затем добавьте 10 микролитров раствора бассейна OLP в 15-миллилитровую пробирку, содержащую два миллилитра облученных дендритных клеток в бессывороточной среде, тем самым разбавив ДМСО в двести раз.
Храните оставшийся запас OLP для бассейна при температуре 20 градусов Цельсия. Инкубируйте ДК с бассейном OLP при комнатной температуре в течение трех часов. Аккуратно встряхивайте клетки каждые 15 минут рукой.
Во время инкубации используйте набор для очистки CD8+Т-клеток из собранной селезенки или лимфатических узлов мыши. Приготовьте пять миллилитров раствора с 10 миллионами Т-клеток на миллилитр бессывороточной среды с 50 единицами на миллилитр интерлейкина 2 и 100 единиц на миллилитр интерлейкина 7. Очищенные CD8 Т-клетки должны быть свободны от гранул или нетронуты.
Поместите по 0,5 миллилитра раствора Т-клеток в каждую из 10 лунок 48-луночного планшета. После завершения инкубации импульсного раствора постоянного тока OLP добавьте в ДК 10 миллилитров среды, не содержащей сыворотки. Центрифугируйте клетки при 300-кратном G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем восстановите клетки в пяти миллилитрах бессывороточной среды. Добавьте по 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую из 10 лунок. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение четырех дней.
Затем удалите по 400 микролитров питательной среды из каждой лунки. Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров свежей безсывороточной среды, содержащей по 100 ЕД на миллилитр ИЛ-2 и ИЛ-7. Инкубируйте клетки еще два-три дня, прежде чем повторно стимулировать клетки, заполненные пулом OLP.
Перед повторной стимуляцией получают и облучают перитонеальные макрофаги мыши. Отрегулируйте концентрацию макрофагов до пяти миллионов клеток на миллилитр бессывороточной среды. Смешайте 10 микролитров запаса ОЛП с двумя миллилитрами облученных перитонеальных макрофагов до получения конечной концентрации ДМСО 0,5% по объему.
Дополните этот раствор 100 ЕД на миллилитр мышиного макрофагального колониестимулирующего фактора. Заполните 48-луночный планшет 200 микролитрами раствора макрофагов OLP-pool в каждой лунке. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.
Затем аккуратно промойте каждую лунку 200 микролитрами предварительно подогретой среды RPMI-0. Раствор макрофагов будет содержать много гранул. Перед добавлением CD8 Т-клеток, подготовленных пулом ОЛП, планшет следует проверить под микроскопом, чтобы убедиться, что во всех лунках нет гранул.
Затем соберите и объедините пул-праймированные CD8+Т-клетки OLP, которые готовы к повторной стимуляции. Отрегулируйте концентрацию Т-клеток до одного миллиона клеток на миллилитр в бессывороточной среде, содержащей 25 единиц на миллилитр ИЛ-2, и 50 единиц на миллилитр ИЛ-7. Добавьте один миллилитр объединенного раствора Т-клеток в каждую лунку, содержащую пул-импульсные макрофаги OLP.
Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение четырех дней. Затем удалите около 400 микролитров среды из каждой лунки. Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров свежей сыворотки безсывороточной среды, содержащей по 100 ЕД на миллилитр ИЛ-2 и ИЛ-7.
Возобновите инкубацию в прежних условиях. Через три-четыре дня исследуйте рестимулированные клетки на специфичный для пула ОЛП ограниченный ответ Qa-1 с помощью иммунологического анализа иммунофермента, связанного с интерфероном-гамма. Обновляйте среду CD8+T-клеток каждые три-четыре дня в ожидании результатов.
Проведите анализ ELISPOT с разбавленными запасами пептидов, чтобы определить, какие пептиды продуцируют специфичную для пула ОЛП секрецию интерферона-гамма-гамма Qa-1. Наконец, оцените усеченный пептидный ряд с помощью ELISPOT, чтобы определить оптимальный эпитоп Qa-1. Интерферон-гамма-анализ ELISPOT показал значительное увеличение количества пятнообразующих клеток, когда CD8+T-клетки, стимулированные объединенной библиотекой перекрывающихся пептидов MOG, были объединены с C1R.
Qa-1b клетки. Это позволяет предположить, что Т-клетки реагируют на пептиды, связывающие Qa-1, и что MOG_pool содержит один или несколько эпитопов, связывающих Qa-1. Был проведен еще один анализ для скрининга отдельных пептидов в бассейне.
Три пептида показали ответ, который был, по крайней мере, в три раза выше, чем ответ в присутствии C1R. Qa-1b клетки без пептидов. Из них для дальнейшей оценки был выбран пептид с наибольшим ответом.
Для выявления оптимального эпитопа Qa-1 была проведена оценка библиотеки усеченных пептидов на основе представляющего интерес 15-мерного пептида. Эпитоп в идеале должен быть от восьми до 10 мер, при этом предпочтение отдается девяти мерам. Кроме того, оптимальный эпитоп должен демонстрировать аналогичный или более сильный ответ интерферона-гамма, чем пептид 15-мер.
Девятимерный N-концевой усеченный пептид лучше всего соответствует этим критериям, что делает его оптимальным эпитопом Qa-1. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунной регуляции к открытию новых эпитопов Qa-1 для изучения иммунной регуляции в других тканях, таких как поджелудочная железа. Не забывайте, что работа с радиацией может быть крайне опасной.
Исследователи должны строго следовать политике учреждения и проходить соответствующую подготовку.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается метод идентификации Qa-1-эпитопов в белках, что имеет решающее значение для понимания механизмов иммунной регуляции. Метод заключается в создании библиотеки перекрывающихся пептидов, способных стимулировать Qa-1-рестриктные CD8 T-клетки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Аутоиммунитет
- Разработка методов терапии
Введение
- Qa-1 представляет собой неклассическую молекулу главного комплекса гистосовместимости.
- Иммунизация эпитопами, связывающимися с Qa-1, может улучшить иммунную регуляцию.
- Данный метод имеет потенциал применения при лечении аутоиммунных заболеваний.
- Он может быть применен как для животных моделей, так и для регуляции иммунитета человека.
Цель исследования
- Для идентификации эпитопов Qa-1 в белках.
- Для углубления понимания механизмов иммунной регуляции и иммунотерапии.
- Для разработки терапевтических стратегий лечения иммуноопосредованных заболеваний.
Используемые методы
- Проектирование библиотеки 15-мерных пептидов.
- Обеспечение перекрытия соседних пептидов на 11 аминокислот.
- Картирование пептидов для стимуляции CD8 T-клеток с ограничением по Qa-1.
- Применение метода как в исследованиях на животных, так и в исследованиях на людях.
Основные результаты
- Метод прост и эффективен.
- Картографированные пептиды успешно стимулируют CD8 T-клетки, ограниченные Qa-1.
- Полученные данные могут быть использованы при разработке методов терапии таких заболеваний, как рассеянный склероз.
- Существует потенциал для более широкого применения в регуляции иммунитета.
Выводы
- Данный метод дает ценную информацию об иммунорегуляции, опосредованной Qa-1.
- Он открывает перспективы для разработки методов терапии аутоиммунных заболеваний.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения в иммунотерапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Идентификация функциональных эпитопов Qa-1 позволяет снизить механистические риски при выборе иммунорегуляторных мишеней в программах по изучению аутоиммунных заболеваний. Данный подход способствует валидации мишеней, связывая пептидные последовательности с активацией CD8+ T-клеток, ограниченной Qa-1, что обеспечивает прогностическую уверенность в эпитоп-специфической иммуномодуляции. Метод ускоряет поиск перспективных кандидатов в рамках разработки иммунотерапии за счет быстрого картирования иммуногенных регионов в белках, имеющих значение для патогенеза заболеваний, таких как миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования эпитопов, связывающихся с Qa-1 и индуцирующих ответы регуляторных CD8+ T-клеток.
- Практическая ценность: использование библиотек перекрывающихся пептидов для систематического сканирования белковых последовательностей на наличие иммуногенных участков с функциональной валидацией с помощью IFN-γ ELISPOT.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков путем подтверждения эпитоп-специфической иммунной регуляции в моделях заболеваний, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественное определение IFN-γ для ранжирования пептидных кандидатов по силе стимуляции относительно контролей.
- Практическая ценность: устанавливает воспроизводимый рабочий процесс скрининга с использованием облученных дендритных клеток и макрофагов для презентации пептидов CD8+ T-клеткам.
- Научная ценность: позволяет проводить анализ усечения для определения минимальных эпитопов (8–10 меров) с оптимальной активностью для последующего применения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет картировать эпитопы в антигенах, имеющих значение при заболеваниях (например, MOG), для изучения иммунной регуляции в таких тканях, как поджелудочная железа и ЦНС.
- Практическая ценность: предоставляет переносимую платформу от систем Qa-1 мыши к системам HLA-E человека для межвидовой валидации мишеней.
- Научная ценность: способствует выбору доклинических моделей путем идентификации эпитопов, усиливающих специфическую для миелина иммунную регуляцию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на ранних этапах поиска для обоснования идентификации ведущих соединений, в частности, для иммуномодулирующей терапии, нацеленной на аутоиммунные пути.
- Фундаментальная биология: Проверка гипотез об иммунной регуляции путем установления связи между участками белков и активацией Т-клеток, ограниченной Qa-1.
- Скрининг: Предоставление готовых к анализу пулов пептидов и отдельных пептидов с подтвержденной иммуностимулирующей активностью.
- Аналитика: Использование метода ELISPOT для количественного определения пятнообразующих клеток, что позволяет осуществлять приоритизацию эпитопов на основе полученных данных.
- Трансляционные исследования: Связь картирования эпитопов с функциональными результатами в моделях аутоиммунных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создание воспроизводимого алгоритма картирования эпитопов, применимого к нескольким антигенам, имеющим значение при различных заболеваниях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение точности прогнозирования при выборе мишеней путем валидации функциональных эпитопов, обеспечивающих иммунную регуляцию.
- Операционная ценность: стандартизация процесса поиска эпитопов за счет использования перекрывающихся пептидов и контролируемой стимуляции клеток.
- Стратегическая ценность: снижение биологических рисков при разработке иммунотерапии путем раннего подтверждения механизма действия.
- Влияние на портфель: возможность продвижения кандидатов на основе эпитопов с доказанными иммуномодулирующими эффектами с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области иммунологии, работы с пептидами и методов стерильного культивирования клеток.
- Зависит от доступа к линиям CD8+ T-клеток, ограниченных по Qa-1, и антигенпрезентирующим клеткам (дендритным клеткам, макрофагам).
- Необходимы стандартизированные реагенты, включая IL-2, IL-7 и M-CSF, для культивирования T-клеток и дифференцировки макрофагов.
- Предусматривает соблюдение мер биологической безопасности при работе с облученными клетками и запасами пептидов в DMSO.
- Опирается на инфраструктуру ELISPOT для высокочувствительного детектирования секреции IFN-γ в качестве функционального показателя.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Overlapping Peptide (OLP) Library Generation and T Cell Priming with OLP Pool-pulsed Dendritic Cells (DCs) Protocol
3:43
Re-stimulation of OLP Pool-primed CD8+ T Cells Using Macrophages Pulsed with the OLP Pool
6:19
Results: Identification of a 9-mer Qa-1 Epitope in Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)
7:32
Conclusion
