Анализ клеточного цикла

Клеточный цикл относится к совокупности клеточных и биохимических процессов, происходящих внутри клетки, которые приводят к ее делению. Клетка проходит через различные стадии цикла, и время, затрачиваемое на завершение этого процесса, практически постоянно для каждого типа клеток. Любое отклонение от этой продолжительности свидетельствует об аномальном делении клеток. Таким образом, анализ клеточного цикла становится очень полезным инструментом для биологов, заинтересованных в изучении механизмов деления клеток, что в конечном итоге поможет в лечении пациентов с такими заболеваниями, как рак, при которых клеточный цикл нарушается.

В этом видео будет рассмотрен принцип и обобщенный протокол анализа клеточного цикла. Наконец, мы покажем некоторые применения этого часто используемого метода.

Давайте узнаем, что такое анализ клеточного цикла, и как он работает.

По сути, анализ клеточного цикла смешанной популяции говорит нам, сколько клеток находится в каждой из различных фаз. Чаще всего это делается путем оценки содержания ДНК в клетке. Вы можете подумать: зачем содержание ДНК? Чтобы понять это, давайте кратко рассмотрим, что происходит с хромосомной ДНК по мере того, как клетка продвигается по кругу.

Во время фазы G1 содержание ДНК в клетке не изменяется. Через S-фазу происходит репликация ДНК, и к концу этой фазы содержание ДНК удваивается. В фазе G2 клетки проверяют отсутствие ошибок в дупликации ДНК, и, наконец, в конце стадии М эта ДНК поровну делится на две дочерние клетки. Таким образом, мечение ДНК может помочь ученому определить стадию клеточного цикла.

Одним из важных соображений при этой маркировке является выбор ДНК-связывающего красителя. Бромоксиуридин, или BrdU, является аналогом нуклеиновой кислоты и структурно имитирует тимидин. Это позволяет BrdU встраиваться в растущую цепь во время репликации ДНК. Таким образом, этот краситель помечает клетки только в S-фазе. После включения BrdU нити ДНК разделяются, и BrdU обнаруживается с помощью флуоресцентно меченных антител.

Другие соединения, такие как йодид пропидия или PI, который по своей природе флуоресцентный, интеркалируются между двухцепочечными нуклеиновыми кислотами и, следовательно, окрашивают клетки на всех стадиях. Тем не менее, количество окрашивания PI пропорционально количеству ДНК.

Хотя выбор пятна зависит от проводимого эксперимента, исследователи часто используют процедуры двойного окрашивания. Молекулы, такие как PI, которые пропорционально связываются со всеми клетками, могут легко дифференцировать клетки G1 от клеток G2 или M-фазы. Тем не менее, ячейки S-фазы все еще находятся в переходном периоде. Таким образом, добавление молекул типа BrdU, которые помечают только клетки S-фазы, увеличивает специфичность детектирования стадий клеточного цикла. Наконец, клетки анализируются с помощью проточной цитометрии для перечисления клеток на разных стадиях клеточного цикла.

Теперь, когда вы понимаете принципы окрашивания клеточного цикла, давайте обсудим процедуру с использованием BrdU и PI.

Установите чашки для клеточных культур: одну для эксперимента и еще три в качестве контрольной. При примерно 60% конфлюенции BrdU, растворенный в питательных средах, добавляют к живым клеткам с последующей инкубацией. На этой стадии BrdU встраивается в реплицирующуюся ДНК.

После инкубации клетки центрифугируют и ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем клетки фиксируются путем добавления клеточной суспензии по каплям в ледяной 70% этанол при мягком вортексе. Это останавливает деление клеток и предотвращает слипание.

Неподвижные элементы снова центрифугируются и ресуспендируются в PBS. Затем в клетки по каплям добавляют концентрированный раствор кислоты, содержащий детергентное средство, такое как Triton-X. Детергент проникает в клетки, обеспечивая проникновение непроницаемых для мембран соединений, а кислота снижает pH и денатурирует ДНК, обнажая BrdU. Затем клетки центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, а гранулу ресуспендируют в щелочном растворе для восстановления pH.

Наконец, клетки промывают PBS и инкубируют с антителом BrdU, конъюгированным с флуоресцентной меткой при комнатной температуре. После этого шага образцы следует беречь от света, чтобы избежать фотообесцвечивания.

При двойном окрашивании клетки инкубируются с PI и РНКазой. РНКаза необходима для удаления двойных нитей РНК-РНК или РНК-ДНК, которые также связываются с ПИ и могут давать ложноположительные результаты. Затем клетки пропускают через клеточное сетчатое фильтр для получения суспензии одиночных клеток, которая необходима для проточного цитометрического анализа.

Теперь, когда вы изучили протокол окрашивания, давайте рассмотрим, как анализировать полученные данные.

Вкратце, при проточной цитометрии лазерный луч светит на узкий поток одиночной клеточной суспензии, и излучение на определенных длинах волн от красителей в каждой клетке регистрируется как одно событие на диаграмме рассеяния.

Здесь диаграмма рассеяния окрашенных ПИ клеток показывает два отдельных кластера, один из которых содержит почти в два раза больше ПИ, чем другой. После оптимизации PI-детектора эти наборы отображаются в виде двух пиков при анализе гистограммы. Пик при большей интенсивности PI представляет G2/M клетки, а при более низкой интенсивности — G1-клетки. Области под этими пиками представляют собой количество ячеек в соответствующих фазах.

Аналогичным образом, события BrdU-FITC могут быть отображены в анализе гистограммы в логарифмической шкале. Этот график показывает, что BrdU-положительные клетки заметно ярче, чем неокрашенные, и, поскольку только часть популяции находится в S-фазе, можно наблюдать больший пик неокрашенных клеток BrdU.

Диаграмма рассеяния ячеек, окрашенных BrdU и PI, может быть отображена с PI на линейной оси X и BrdU на логарифмической оси Y, и это показывает подковообразный узор, идущий от G1, S к G2. Доля ячеек в закрытых зонах может быть определена и отображена на гистограмме.

Теперь, когда мы рассмотрели базовый протокол анализа клеточного цикла, давайте рассмотрим, как его можно использовать в различных экспериментальных установках.

А. Комбинируя генетические манипуляции с анализом клеточного цикла, ученые изучают роль конкретных белков в прогрессии клеточного цикла. В этом исследовании ученые сверхэкспрессировали белок под названием p27 в эмбриональных фибробластах мыши. Результаты показывают, что сверхэкспрессия привела к уменьшению количества клеток в S-фазе, что указывает на то, что этот белок играет решающую роль в регуляции клеточного цикла.

Используя анализ клеточного цикла, ученые могут сравнить кинетику прогрессии. Здесь сравнивалась кинетика прогрессии между двумя клеточными линиями колоректального рака и клеточной линией рака молочной железы. Результаты показали, что клетки рака молочной железы прогрессировали через клеточный цикл медленнее по сравнению с линиями колоректальных клеток, учитывая более высокий процент клеток рака молочной железы в G1 с течением времени.

Наконец, для анализа клеточного цикла in vivo, BrdU может быть введен грызунам, и целевая клеточная популяция может быть выделена для анализа клеточного цикла. В этом исследовании гемопоэтические стволовые клетки или ГСК мышей, которым вводили BrdU, были выделены для проточного цитометрического анализа. Собранные данные показали распределение ГСК по различным стадиям клеточного цикла с преобладанием в G1 и S фазе.

Вы только что посмотрели видео JoVE об анализе клеточного цикла. Мы рассмотрели принципы, лежащие в основе этого процесса, подробно описали пошаговый протокол и рассмотрели, как этот тип анализа используется в различных экспериментальных условиях. Как всегда, спасибо за просмотр!