Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

Общая цель этой процедуры заключается в выделении клеток в различные фазы клеточного цикла с помощью центробежной элютриации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии рака. Потому что выделение клеток в отдельные фазы, позволяет исследовать фазозависимые эффекты противораковых соединений.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет разделять клетки на определенные фазы с использованием физических свойств, а не химических возмущений. Чтобы начать эксперимент, установите стробоскоп в центрифугу таким образом, чтобы шнур питания подавался из камеры через порт слева. Отрегулируйте вспышку стробоскопа так, чтобы она совпадала со смотровым окном, когда центрифуга закрыта.

Закрепите узел на месте, затянув два винта с крестообразным шлицем в верхней части каждого кронштейна. А затем, затянув с накатанной головкой винты в нижней части кронштейна. Подключите шнур питания к порту питания стробоскопа, расположенному в задней части центрифуги.

Затем установите роторы прямо на ступицу привода центрифуги и надежно закрепите ее шестигранным ключом с Т-образной рукояткой. Затем поместите сборку, содержащую камеру элютриации, противовес, вращающееся уплотнение в сборе и монтажную пластину, на ротор. Равномерно надавите вниз, положив одну руку на элютриационную камеру, а другую руку на противовес, пока болты на роторе не встанут на свои места.

Вставьте штифт, расположенный на одном конце кабеля, в отверстие во вращающемся узле уплотнения. И закрепите отверстие с проушиной на другом конце одним из винтов с крестообразным шлицем, прикрепленных к кронштейну для подключения анкерного кабеля. Чтобы собрать проточную систему, закачать буфер в камеру элютриации и из нее, подсоедините трубку типоразмера 16 к насосу с регулируемой частотой вращения.

Вставьте один свободный конец этой трубки через порт в верхнем левом углу камеры центрифуги таким образом, чтобы он входил в камеру. Прикрепите фитинг к свободному концу этой трубки, а затем вставьте фитинг во входное отверстие узла вращающегося уплотнения. Наконец, вставьте выходную трубку через порт, чтобы прикрепить ее к передаточной трубке в верхней части узла вращающегося уплотнения.

После того, как система элютриации собрана, простерилизуйте ее, поместив другой свободный конец входной трубки в бутылку объемом 500 миллилитров, наполненную 5% отбеливателем. И помещаем выходную трубку в пустую литровую бутылку для отходов. Затем включите насос и дайте отбеливателю протечь через всю систему элютриации, пока он не будет откачан в бутылку для отходов.

Теперь включите центрифугу и дайте ей набрать максимальную заданную скорость, чтобы выпустить пузырьки и противодавление. Как только заданная скорость будет достигнута, остановите центрифугу. После того, как ротор полностью остановится, откройте крышку и осмотрите камеру на предмет утечек.

Затем, таким же образом, как описано ранее, пропустите стерильную воду через систему в течение 10 минут. После промывки водой замените резервуар для воды стерильной стеклянной бутылкой, наполненной 100 миллилитрами элютриирующего буфера. Поместите входную трубку в эту бутылку так, чтобы она оказалась на самом дне.

Запустите центрифугу и дайте буферу пройти через систему. После того как бутылка с резервуаром почти опустена, а вода полностью вымыта из системы, переместите выходную трубку из бутылки для отходов в резервуар, чтобы буфер непрерывно циркулировал через систему. Наконец, включите стробоскоп и поверните ручку элютриации влево.

Теперь отрегулируйте смотровое окно, медленно поворачивая ручку вправо, чтобы камера элютриации была хорошо видна, а стробоскоп синхронизировался со скоростью ротора. Подготовьте образец клетки, как описано в текстовом протоколе. Добавьте ресуспендированные элементы в бутылку с резервуаром, содержащую буфер для элютриации рециркуляции.

Позвольте клеткам войти в систему и достичь равновесия в камере элютриации. Чтобы убедиться, что все клетки удержались в камере, возьмите каплю элюента на предметное стекло, и рассмотрите ее под микроскопом. Если образец лишен интактных клеток, это подтверждает удержание в камере.

Как только все клетки войдут в камеру и станет видна четкая граница в самой белой части камеры, содержащая клетки и равновесие, приступайте к сбору дробей. Переместите выходную трубку в предварительно охлажденную коническую трубку объемом 50 миллилитров с маркировкой W1. Наберите в эту пробирку 50 миллилитров элютриационного буфера и храните на льду. Вскоре после сбора фракции W1 понизьте скорость центрифуги до 821 G. Переместите выходную трубку в коническую трубку, помеченную W2, и соберите еще 50 миллилитров с такой скоростью.

Продолжайте менять скорость и собирать дроби. Убедитесь, что в баке резервуара есть среда, и всегда храните собранные фракции на льду. После того, как все фракции будут собраны, остановите центрифугу, и соберите 50 миллилитров в коническую пробирку, помеченную стопом.

Гранулированные клетки собираются в каждую из фракций, и при необходимости с помощью последующего анализа, такого как проточная цитометрия или вестерн-блоттинг. Показан линейный график, отображающий средний диаметр ячеек в последовательных фракциях элютриации. Обратите внимание, что чем больше диаметр клетки, тем выше количество фракций, при которой она элюируется.

Результаты анализа сортировки флуоресцентных активированных клеток показывают содержание ДНК клеток в каждой из 20 фракций элютриации. Ранние фракции, от F1 до F5, содержат почти исключительно клетки с содержанием 2N ДНК, представляющей клетки в фазе G1. Смесь клеток в фазах G1 и S была обнаружена в промежуточных фракциях, от F6 до F9. А клетки с содержанием 4N ДНК, представляющие клетки от G2 до M, наблюдались, начиная с F10.

Здесь представлены результаты вестерн-блоттинга, полученные в результате исследования уровней белков, связанных с клеточным циклом, в объединенных фракциях клеток в фазе G1 и от G2 до M-фазы. Как и ожидалось, в пуле G2-M были более высокие уровни фосфо-Rb и циклина B-1 по сравнению с пулом G1. Сигнал циклина D 1 был слабым, но, тем не менее, был обнаружен в пуле G1 и необнаруживаем в пуле G2-M.

После освоения этой техники ее можно сделать за три часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно не торопиться и убедиться, что система элютриации собрана правильно, а все материалы и растворы подготовлены. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ клеточного цикла, анализ жизнеспособности клеток и иммуноблоттинг, чтобы выяснить, как терапевтические соединения могут действовать в зависимости от фазы клеточного цикла.