4.3: Визуализация митоза в живых клетках

Митоз – это высокоорганизованное и контролируемое деление ядерного содержимого, происходящее в течение клеточного цикла. Митоз принципиально важен для правильного развития организма, а также для роста, поддержания и восстановления тканей. Нарушение этого процесса было показано при некоторых заболеваниях, таких как рак. Визуализация живых клеток с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии является одним из наиболее распространенных методов изучения митоза в лабораториях на сегодняшний день.

В этом видео мы кратко познакомим вас с фазами митоза, а затем обсудим экспериментальные соображения для визуализации этого клеточного процесса в живых клетках. Будет показан подробный протокол сбора и анализа данных, и мы закончим несколькими случаями применения этого метода.

Чтобы лучше понять, что ученые ищут в этих экспериментах по визуализации, давайте сначала пройдемся по стадиям митоза.

Клеточный цикл описывает общий процесс роста и деления клеток. Митотическая фаза представляет собой одну короткую часть этого цикла, который может быть разбит на шесть фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза и цитокинез.

Во время профазы ДНК конденсируется в сестринские хроматиды, соединенные в центромере. В цитоплазме две ключевые органеллы, называемые центросомами, начинают собирать структуры микротрубочек, широко известные как веретенообразные волокна, в виде колеса.

Следующая фаза, прометафаза, включает в себя разрушение ядерной мембраны и сборку комплекса белков, известного как кинетохор, в центромерах. На этом этапе также происходит связывание волокон веретена с кинетохором.

В метафазе хромосомы выстраиваются в линию на метафазной пластине, в воображаемой плоскости, равноудаленной от двух центромер. Во время анафазы хромосомы «распадаются» в центромере, при этом отдельные сестринские хроматиды мигрируют на противоположные концы клетки. В телофазе митотическое веретено разбирается, и хроматин начинает деконденсируться. Наконец, во время цитокинеза — через сокращение актин/миозинового кольца, которое образует «борозду расщепления» — родительская клетка делится на две дочерние клетки.

Имея такое понимание митотической прогрессии, давайте рассмотрим практические соображения по наблюдению за этим процессом с помощью визуализации живых клеток.

Первый вопрос, который следует задать: как помечать клетки, чтобы визуализировать митоз? Наиболее часто используемыми «метками» для этого эксперимента являются флуоресцентные молекулы, которые поглощают свет на одной длине волны и излучают свет на другой длине волны.

Чтобы пометить нуклеиновые кислоты, можно использовать проницаемый для клеток ДНК-связывающий краситель, такой как Hoechst. Для мечения белков, таких как микротрубочки, можно использовать флуоресцентно меченные антитела. Они, как правило, непроницаемы для мембран, поэтому для их введения в образцы используются методы микроинъекции.

Другой стратегией является генетическая маркировка, при которой клетками можно манипулировать для экспрессии флуоресцентно меченых белков, которые маркируют компоненты, активно участвующие в митозе, такие как хромосомы. При работе с флуоресцентными молекулами необходимо избегать чрезмерного воздействия света, чтобы избежать фотообесцвечивания.

Выбор правильного микроскопа является не менее важным решением. Двумя наиболее часто используемыми микроскопами являются эпифлуоресцентные и конфокальные. Эпифлуоресцентная или широкопольная микроскопия пропускает свет по всему полю зрения, в то время как конфокальная микроскопия использует лазеры для фокусировки света на отдельных точках.

В то время как эпифлуоресцентные микроскопы, как правило, дешевле, предпочтение отдается конфокальным микроскопам, поскольку точечное освещение обеспечивает повышенное оптическое разрешение, что позволяет получать более четкие изображения. Единая точка освещения также снижает фототоксичность или повышенную гибель клеток, вызванную чрезмерным воздействием света.

Теперь, когда мы рассмотрели некоторые экспериментальные соображения, давайте посмотрим, как провести эксперимент по визуализации живых клеток для визуализации митоза.

Клетки следует культивировать на стеклянных донных посудах или на покровных листах, что позволяет наилучшим образом визуализировать митоз. Затем они должны содержаться в контролируемой среде до тех пор, пока не будет выполнена маркировка. Как уже говорилось ранее, выбор техники маркировки зависит от проводимого эксперимента. После маркировки поместите чашку для клеточной культуры в специализированную камеру на микроскопе. Это позволяет поддерживать условия культивирования клеток во время визуализации.

Далее, в зависимости от молекулы мечения, установите длины волн возбуждения и излучения на микроскопе. Для сбора данных, настройки временных точек и положения для захвата изображений. В этом контексте временные точки — это моменты, в которых будут получены изображения, чтобы обеспечить полное визуальное покрытие всех митотических стадий. Позиции относятся к координатам X-Y на тарелке для культуры. Кроме того, для каждого положения можно получать изображения с разной глубиной резкости. Каждое изображение представляет собой оптический срез по оси Z. Поэтому в совокупности они известны как Z-стеки. После ввода всех параметров протестируйте настройки, а затем откиньтесь на спинку кресла и наслаждайтесь!

Получив данные покадровой съемки, есть несколько способов их представления. Давайте обсудим несколько из этих способов.

Монтаж — это один из наиболее распространенных способов представления данных покадровой съемки, при котором несколько изображений выстраиваются в сетку, основанную на времени. Они могут ясно показать митотическую прогрессию и позволяют исследователям определить такую информацию, как время, проведенное в отдельных митотических фазах. Последовательное объединение этих изображений для создания «фильма» может быть более динамичным представлением.

Наконец, Z-стеки, полученные с помощью конфокального микроскопа, могут быть объединены для представления 3D-воссоздания образца. Это позволяет точно выявить пространственные отношения между частями митотического механизма. Это важно, поскольку компоненты, которые выглядят рядом друг с другом в 2D, на самом деле могут находиться далеко друг от друга в трех измерениях.

Теперь, когда вы знаете, как провести эксперимент по визуализации живых клеток, давайте рассмотрим некоторые применения этого метода.

Митоз является неотъемлемой частью развития. Здесь исследователи изолировали эмбриональный мозг мыши, чтобы наблюдать за митозом в нейронных клетках-предшественниках. Контролируемое деление этих клеток имеет решающее значение для правильного роста и функционирования мозга. После выделения мозг был разделен с помощью вибратомии, окрашен проницаемым для мембраны красителем, связывающим нуклеиновые кислоты, и визуализирован с помощью конфокальной микроскопии для четкой визуализации митоза нейронных клеток-предшественников.

Репарация ДНК является важнейшим клеточным процессом, который участвует в росте и делении клеток. В этом эксперименте исследователи изучили белок репарации ДНК, который образует очаги, которые представляют собой точечные пятна, созданные в ответ на повреждение ДНК. Результаты визуализации живых клеток и 3D-анализа выявили локализацию белка репарации ДНК на протяжении всего процесса деления клетки.

Наконец, исследователи изучают митотические контрольные точки, которые представляют собой точки «паузы», где оцениваются клеточные условия перед продолжением деления. При митозе контрольная точка сборки веретена, или SAC, обеспечивает правильную связь между митотическим веретеном и хромосомами. Чтобы изучить это, ученые вводили микроинъекционные реагенты в трансгенные эмбрионы мух и анализировали митоз с помощью визуализации живых клеток. Результаты показывают остановленные кинетохоры, демонстрирующие клетки, которые не могут прогрессировать через митоз.

Вы только что посмотрели видео JoVE о визуализации митоза в живых клетках. В этом видео, посвященном введению в стадии митоза, представлены важные соображения и методы анализа данных для визуализации живых клеток. Наконец, были представлены приложения этой техники. Визуализация живых клеток существенно помогла ученым в понимании митотических механизмов, связанных с развитием, поддержанием тканей и болезнями. Как всегда, спасибо за просмотр!