Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Общая цель данного эксперимента заключается в разработке анализа для изучения влияния малых молекул на модуляцию агрегации неправильно свернутых белков в зависимости от времени и дозы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы для развития клеточного анализа, и он используется для методов скрининга с высоким содержанием спермы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой метод обнаружения и количественной оценки агрегации белков, происходящей при нескольких нейродегенеративных расстройствах.

Применение этого метода распространяется на потенциальную терапию нейродегенеративных заболеваний, таких как БАС, поскольку он предлагает простой метод, позволяющий разрабатывать клеточный анализ и проводить скрининг низкомолекулярных замедлителей. Чтобы начать производство вируса, перед трансфекцией плазмид Т-клетки HEK-293 расщепляют при конфлюенции от 30 до 40% в 10-сантиметровой чашке для культуры тканей и 10 миллилитрах среды для культивирования клеток. Инкубируйте культуральную пластину в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день приготовьте раствор для трансфекции ДНК с упаковкой плазмид лентивирусного вектора, 125 микролитров одного моляра хлорида кальция и добавьте дистиллированную воду, доведите объем до 500 микролитров. Аккуратно добавьте 500 микролитров 0,05 молярного буфера HEPS и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого замените Т-клеточную среду HEK-293 10 миллилитрами предварительно подогретой свежей питательной среды без антибиотиков, смешанной с одним миллилитром раствора для трансфекции ДНК.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение ночи. На следующий день замените надосадочную жидкость свежей питательной средой и снова инкубируйте в течение ночи. Наконец, на следующий день соберите надосадочную жидкость и переложите в 15-миллилитровую трубку.

Чтобы удалить мертвые клетки и мусор, центрифугируйте пробирку при 500-кратном g в течение пяти минут. Чтобы дополнительно очистить надосадочную жидкость, пропустите ее через фильтр 0,45 микрометра с помощью 60-миллилитрового шприца. Затем немедленно раздайте отфильтрованную надосадочную жидкость в 300 микролитровых одноразовых аликвотах.

Чтобы подготовить клетки к трансдукции, разделите их для инфицирования при 60% конфлюенции в шестилуночном тканевом планшете в двух миллилитрах DMAM с добавлением 10% FBS. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе в течение ночи. На следующий день размораживайте по одной аликвоте замороженного лентивируса на льду для каждого использования.

Тем временем нагрейте среду для культивирования клеток, содержащую сыворотку, совместимую с представляющей интерес клеточной линией. Как только вирус полностью разморозится, разведите его в DMEM в новых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров. Затем отрегулируйте объем до одного миллилитра с уменьшенным содержанием сыворотки среды.

Далее добавьте два микролитра полибрена к одному миллилитру вируса на одну среду и хорошо перемешайте с помощью пипетирования. Добавьте в клетки один миллилитр этой смеси и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации удалите среду, содержащую вирус, и замените ее на обычную DMEM с добавлением 10% FBS и верните клетки в инкубатор.

Следите за ростом клеток и меняйте среду каждые два дня Когда клетки достигнут слияния, разверните каждую лунку шестилуночной чашки в 10-сантиметровую тарелку для культуры тканей. Переместите пластины в инкубатор. Наконец, сэкономьте в 1,5 раза от 10 до 4-х клеток на лунку и 50 микролитров DMEM на 384 луночных планшетах.

Затем проверьте уровень экспрессии белка, меченного YFP, под микроскопом. Если в выражении отношение сигнал/шум равно или больше трех, подготовьте запас клеток для соответствующей клеточной линии. Для переноса соединений на полипропиленовую пластину с 384 лунками добавьте последовательные разведения соединений стандартными сериями разбавления от одного до трех разбавлений.

Затем, используя манипулятор для жидкостей, оснащенный 384-капиллярной головкой, распределите 0,25 микролитра ингибиторов протеасом на пустых черных 384-луночных планшетах с плоским дном. Затем засейте 1,5 раза по 10 до 4-х ячеек на этих пластинах. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.

Перед визуализацией клеточной линии, обработанной ингибиторами протеасом, добавьте 10 микролитров предварительно подогретого DMEM с окрашивающим раствором и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. После окрашивания запустите программное обеспечение для работы автоматического микроскопа, выбрав вкладку «Микроскоп». Сначала выберите вкладку конфигурации, а затем выберите 20 раз объектив в правильном типе пластины.

Чтобы обеспечить правильную фокусировку при работе с различными типами пластин, убедитесь, что вызывающий абонент настроен на правильное значение цели. Далее выберите экспозицию одну. Установите высоту фокусировки равной нулю микрометров, затем выберите фокус.

Как только он будет сфокусирован, выставьте камеру один. Чтобы оптимизировать плоскость экспозиции, отрегулируйте высоту фокусировки и нажмите на высоту захвата. Изменяйте время экспозиции и мощность лазера для максимальной интенсивности пикселя около 3000 и сохраняйте параметры экспозиции.

Выберите вкладку Определение эксперимента, создайте макет и вложенный макет. Затем перетащите соответствующую экспозицию макета, эталонное изображение, файл обрезки с наклоном и подмакет. Затем сохраните эксперимент.

Наконец, выберите вкладку «Автоматический эксперимент» и получите изображения. Для двухканальных изображений сначала выберите программный алгоритм для сегментации первичных объектов, таких как ядра, цитозоль и агрегаты. Сначала распределите 0,25 микролитра ингибитора протеасом, растворенного в 100% ДМСО или ДМСО, на 384-луночных планшетах с плоским дном.

На эту же пластину вручную засейте 1,5 раза по 10 до 4-х ячеек на лунку в 50-мк DMEM. Затем установите микроскоп на блок контроля окружающей среды на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Работайте с микроскопом в широкопольном режиме флуоресценции и в качестве настроек программного обеспечения выберите неконфокальный режим LWD с 20-кратным объективом, четыре поля на лунку и интервал съемки один час.

Затем выберите подходящий алгоритм для сегментации первичного объекта, такого как цитозоль и агрегаты. При необходимости настройте порог фона и параметры контрастности. Испытуемые клеточные линии, трансдуцированные диким типом SOD-1 и мутантом SOD-1 A4V, оставались здоровыми, демонстрировали высокий уровень экспрессии и долгосрочное широкое мечение фи независимо от формы SOD.

Лечение ингибитором протеасом ALLN в течение 24 часов способствовало накоплению агрегатов SOD-1 A4V YFP в клетках HEK-293, но не в клетках, трансдуцированных SOD-1 Wild Type YFP. Кроме того, наблюдались очень низкие уровни агрегации в линиях U2 OS и SH-SY5Y клеточных линий SOD-1 A4V YFP, трансдуцированных теми же векторами. После посева клеток в присутствии или отсутствии ALLN их контролировали на предмет образования агрегатов в течение 50 часов.

Формирование агрегата ALLN достигло плато в течение 24 часов и оставалось стабильным в течение следующих 12 часов. Кроме того, плотность клеток значительно снизилась через 28 часов в результате цитотоксического действия ALLN, в то время как количество клеток увеличилось в отрицательном контроле, обработанном ДМСО. Клетки СОД-1 A4V YFP, культивируемые в присутствии ингибиторов протеасом, в течение 24 ч окрашивали раствором Хёхста.

Относительная токсичность для трех различных ингибиторов протеасом была квалифицирована путем измерения количества адгезивных клеточных линий, оставшихся в лунке, меченной красителем Хёхста. Общее количество клеток уменьшалось в ответ на увеличение дозы ингибиторов протеазы. И наоборот, процент клеток, экспрессирующих агрегаты SOD-1 A4V, увеличивался с концентрацией ингибитора протеазы.

При выполнении этого процесса важно помнить, что качество клеток кардинально повлияет на ваш результат. Поэтому важно определить, что клетки свободны от микроплазмы и здоровы на всех этапах. После этого процесса можно использовать другой метод визуализации, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся деградации белка или взаимодействия белка с другими белками с помощью резонансного переноса энергии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать инструменты для проверки судьбы белка в нескольких живых клетках с помощью анализа изображений с высоким содержанием. Таким образом, этот метод может дать представление об агрегации белков в том виде, в каком она происходит в простых клеточных моделях. Он также может быть применен к другим системам, таким как нейроны, дифференцированные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, специфичных для пациента.