Сверхэкспрессия и очищение человека Cis -пренилтрансфераза в Escherichia coli

Общая цель этого протокола заключается в сверхэкспрессии и очистке кодон-оптимизированной цис-пренилтрансферазы человека в условиях, не связанных с денатурацией, а также в анализе ее ферментативной активности. Процедура продемонстрирована на примере эукариотической длинноцепочечной цис-пренилтрансферазы дегидродолихилдифосфатсинтазы, или DHDDS. Этот метод может улучшить наше понимание синтеза изопреноидов и дать ключевое представление о патофизиологическом механизме пигментного ретинита, связанного с мутациями в DHDDS.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он прост, экономичен и экономит время. Он также может быть обобщен для производства в больших количествах других белков цис-пренилтрансферазы. Начните эту процедуру с клонирования экспрессии DHDDS человека, как описано в текстовом протоколе.

Ресуспендируйте клетки в буфере А, одном микрограмме на миллилитр ДНКазы I и смеси ингибиторов протеазы. Затем гомогенизируйте ресуспендированные клетки с помощью гомогенизатора из стеклотефлона. Разрушайте клетки с помощью микрофлюидизатора или его эквивалента при давлении от 12 000 до 15 000 фунтов на квадратный дюйм.

Затем центрифугируйте клеточный лизат при 40 000 умноженных на g в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. Восстановите надосадочную жидкость, содержащую растворимую фракцию. Загрузите надосадочную жидкость в 5-10-миллиметровую иммобилизованную кобальт-аффинную хроматографическую колонку с 10 миллимолярным имидазолом.

После загрузки в аппарат быстрой жидкостной хроматографии белка проведите тщательную промывку колонки буфером А в 10 миллимолярном имидазоле с целью снижения неспецифического связывания белка. Начните обучение по программе FPLC. Элюируйте сверхэкспрессированные белки с помощью буфера А с добавлением 250 миллимолярного имидазола.

После элюирования удалите имидазол с помощью 53 миллилитров препаративной обессоливающей колонки, уравновешенной буфером А. Затем добавьте меченную гексахистидином протеазу TEV к элюированным белкам, чтобы удалить их меченный гексахистидином тиоредоксин DHDDS. Инкубируйте смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Затем загрузите расщепленные белки на иммобилизованную кобальтом аффинную хроматографическую колонку, уравновешенную буфером А, дополненным пятью миллимолярами имидазолом.

Соберите проточный поток, чтобы удалить расщепленный тиоредоксин, меченный гексахистидином, и протеазу TEV. Сконцентрируйте проточный поток до трех-четырех миллилитров с помощью центробежного фильтра с молекулярной массой 30 килодальтон. Затем загрузите концентрированный белок в колонку для эксклюзионной хроматографии Superdex 200, уравновешенную буфером А для окончательной очистки.

Поместите образцы в штатив на 96 лунок в сборнике фракций. Белок элюируется в виде димера. Выберите соответствующие дроби, сравнив профиль элюирования с калибровочной кривой столбца.

На этом этапе оцените чистоту препарата с помощью SDS-PAGE. Наконец, определите концентрацию белка, необходимую для последующих экспериментов, и заморозьте аликвоты очищенных концентрированных белков в жидком азоте. Храните аликвоты при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования.

Чтобы обеспечить способность белка выдерживать циклы замораживания-оттаивания, размораждайте аликвоту замороженных белков. Центрифугируйте аликвоту при 21 000 раз g в течение 10 минут, чтобы удалить нерастворимые агрегаты. После центрифугирования соберите надосадочную жидкость.

Затем загрузите белки на аналитическую колонку Superdex 200, предварительно уравновешенную с TNXB, с использованием ультрапроизводительной системы жидкостной хроматографии. Контролируйте флуоресценцию триптофана, чтобы определить профиль элюирования белка. Убедитесь, что у вас есть действительная калибровочная кривая для оценки молекулярной массы, которую можно получить у производителей колонок SEC.

Чтобы обеспечить активность очищенного белка, сначала смешайте пять микромоляров очищенного DHDDS с 10 микромолярами FPP и 50 микромолярами C14 IPP. Начинайте реакцию в буфере А с 0,5 миллимоляра хлорида магния при температуре от 22 до 30 градусов Цельсия. Извлекают 15 микролитров образцов из реакции через ноль, два, четыре и шесть часов после немедленного гашения реакции путем добавления 15 микролитров буфера А с добавлением 20 миллимолярных ЭДТА.

Затем добавьте один миллилитр насыщенного водой 1-бутанола и тщательно перемешайте, чтобы извлечь продукты реакции. Здесь протокол может быть остановлен, а образцы могут быть сохранены для последующего чтения. Далее добавьте к образцам сцинтилляционный коктейль.

Используя сцинтилляционный счетчик, количественно определить продукты реакции в бутаноловой фазе, охватывающей C14, вместе с радиоактивностью 15 микролитров реакции, представляющими общую радиоактивность. Наконец, рассчитайте чистое включение C14 IPP в каждый момент времени, вычислив процент использования от общей концентрации C14 IPP, и нанесите результаты в зависимости от времени. Со временем ожидается увеличение чистой инкорпорации C14 IPP.

Образцы, полученные на каждой стадии очистки, показаны здесь. Этот анализ SDS-PAGE показывает ступенчатую очистку DHDDS, в результате которой получается продукт высокой очистки. Эта хроматограмма представляет собой результаты аналитической эксклюзионной хроматографии очищенного фермента, показывающие, что белок наблюдается только в виде гомодимера.

Здесь стрелка указывает на объем пустоты. Репрезентативный анализ активности, зависящий от времени, показывает, что инкорпорация C14 IPP четко возрастает в течение шести часов, подтверждая работоспособность очищенного фермента. После освоения этого простого препарата его можно сделать за два-три дня, в результате чего получается высокочистый и активный фермент.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как сверхэкспрессировать и очищать цис-пренилтрансферазу человека из E.coli и измерять ее активность в зависимости от времени.